EFFECTS OF AFLATOXIN B1 ON GROWTH AND TISSUE ACCUMULATION OF JUVENILE GRASS CARP (CTENOPHARYNGODON IDELLUS)
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摘要: 以含不同浓度黄曲霉毒素B1(AFB1)(0、10、20、100、1000和5000 μg/kg饲料)的6种等氮等能(32.96%蛋白质, 14.55 kJ/g能量)配合饲料饲喂平均初始体质量为(2.90±0.16) g草鱼(Ctenopharyngodon idellus)幼鱼84d, 探讨AFB1对草鱼幼鱼生长、肝胰脏和肾脏组织结构以及鱼体肌肉中的毒素积累的影响。实验分为6个实验组, 每组3个平行。结果表明, 在整个实验过程中各实验组幼鱼的行为均未表现出异常, 各组幼鱼的存活率、终末体重、摄食率、特定生长率、饲料效率、肝体比、脏体比均无显著差异。饲料AFB1水平对草鱼幼鱼血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均无显著影响。各毒素组和对照组肝胰脏、肾脏组织学观察中未发现病理变化。摄食AFB1≤1000 μg/kg的草鱼幼鱼肌肉中未检测出AFB1残留, 仅在5000 μg/kg实验组中检测出肌肉中含有(1.21±0.18) μg/kg的AFB1, 低于FDA食品安全限定标准。由此可见, 草鱼幼鱼至少可耐受AFB1含量达5000 μg/kg饲料(实测值: 4979.2 μg/kg饲料) 84d。Abstract: A 84-day feeding trial was conducted to evaluate the effects of dietary aflatoxin B1 (AFB1) on growth, physiological responses, histological changes, and accumulation in juvenile grass carp (Ctenopharyngodon idellus). Triplicate groups of grass carp [(2.90±0.16) g] were fed with six semipurified diets formulated with isonitrogenous (crude protein: 32.96%), isocaloric (gross energy: 14.55 kJ/g) containing 0, 10, 20, 100, 1000 and 5000 μg/kg AFB1. AFB1 did not significantly impact behavior, the survival rate, final body weight (FBW), feeding rate (FR), specific growth rate (SGR) or feed efficiency (FE). No significant differences were found in hepatosomatic index (HSI) and viscera index (VSI) among all groups. AFB1 had no significant effect in activities of serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px). No significant histological lesions in hepatopancreas and kidney were identified between the control and increasing AFB1 treatments. No AFB1 residue was detected in muscles when fish fed with AFB1 up to 1000 μg/kg, however, tiny dose [(1.21±0.18) μg/kg] of AFB1 were detected in muscles in the group with 5000 μg/kg AFB1, which was below the safety limitation of FDA. The results indicated that juvenile grass carp is a little susceptible species to AFB1 exposure up to approximately 5000 μg/kg diet (determined level was 4979.2 μg/kg diet), at least for 84 days.
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Keywords:
- Aflatoxin B1 /
- Ctenopharyngodon idellus /
- Growth /
- Liver /
- Kidney /
- Accumulation
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随着鱼粉资源日趋紧张, 鱼粉价格不断上涨。为了降低饲料生产成本, 水产饲料中多使用植物性蛋白, 如大豆、玉米蛋白粉等, 特别是在热带和亚热带地区, 这些饲料原料和饲料成品在加工、运输、保存过程中管理不当容易造成黄曲霉毒素(AFT)的污染[1]。AFT是霉菌次生代谢过程中产生的一类具有相似结构的有毒产物, 拥有1个糖酸呋喃和1个氧杂萘邻酮(香豆素)结构[2]。黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)是主要产生AFT的真菌, 在潮湿或阴雨天气的情况下, 极易导致上述2种真菌大量繁殖并产生AFT。曲霉菌通过空气、土壤或昆虫等途径传播到农作物和饲料储藏处, 在适宜的环境中繁殖并产生多种AFT, 最常见的有黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2 (AFB2)、黄曲霉毒素G1 (AFG1)和黄曲霉毒素G2 (AFG2), 其中黄曲霉毒素B1(AFB1)具免疫毒性、肝毒性和基因毒性, 可引起多种疾病的发生[3]。
国内外有关AFB1对水产动物影响的研究, 主要集中于尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)[4－7]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[8, 9]、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[10, 11]、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[12]、南亚野鲮(Labeo rohita)[13]等种类。尼罗罗非鱼摄入含AFB1的饲料10周后, 生长减缓, 死亡率升高[14]。用含不同浓度的AFB1饲料饲喂异育银鲫(Carassius auratus gibelio)成鱼24周, 各毒素处理组鱼体生长和饲料利用较对照组无显著差异, 但对其生殖功能有一定影响[15]。不同水产动物对AFB1的敏感性差别很大, 此外AFB1毒性的大小还受到毒素浓度、暴露时间、年龄、性别等因素的影响[1, 4, 5, 8, 9]。AFB1污染不仅会造成水产动物生长性能降低, 免疫抑制, 肝脏能损伤, 而且会积累在水产动物的体组织中, 随食物链在生态系统中进一步传播, 有可能威胁到人类的健康。
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为我国传统的四大家鱼之一, 隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae), 雅罗鱼亚科(Leuciscinae)、草鱼属(Ctenopharyngodon), 为我国养殖产量最大的淡水养殖鱼类, 其配合饲料生产上多选用植物原料作其蛋白源。同时在我国南方渔民多习惯在塘头储存饲料, 而在高温、高湿的环境下, 原料及饲料感染黄曲霉的可能性极大, 这进一步提高了草鱼发生AFT中毒的概率。以往有关AFB1对水产动物的报道多集中于对水生动物急性毒性的研究, 研究方法多采用腹腔注射、灌喂等方式, 关于摄食途径导致亚慢性致毒的研究相对较少[4, 13]。但在实际生产中水产动物暴露于AFB1的方式主要是通过摄食被毒素污染的谷物和饲料, 因此, 相对于急性暴露, 研究动物长期摄入含AFB1的饲料, 更接近天然状态的AFB1摄入途径。迄今为止, 有关AFT在水产养殖动物中的代谢机理和毒理学研究尚不完整, 也仅涉及少数品种[5, 8, 12]。关于草鱼AFB1的亚慢性中毒的研究鲜见报道。AFB1的毒性大小与受试动物的生长阶段相关, 有报道表明鱼苗阶段比成鱼更易发生AFT中毒[16]。本论文采用草鱼幼鱼为实验对象, 研究不同浓度AFB1对草鱼幼鱼的生长、饲料利用、肝胰脏和肾脏组织学以及肌肉毒素残留的影响, 评估饲料中的AFB1对草鱼养殖和食品安全的潜在隐患。
1. 材料与方法
1.1 养殖系统
微流水养殖系统由18个圆形塑料(pp)养殖桶(直径80 cm, 高70 cm, 水体体积为180 L/缸)组成, 每缸水流速度0.6 L/min。每天测2次气温和水温, 每2周检测水体溶氧和氨氮。实验期间, 水温为22—28℃; 饲养用水为经曝气的自来水, 保持水体中的溶解氧含量在6 mg/L以上, 氨氮范围为0.2—0.4 mg/L, pH为6.8—7.0。光照周期12L﹕12D, 光照周期为8:30到20:30。
1.2 实验饲料及实验设计
设置了不同浓度梯度AFB1(0、10、20、100、1000和5000 μg/kg)的6种等氮等能(32.96%蛋白质, 14.55 kJ/g能量)饲料(表 1)。其中, 蛋白源为白鱼粉和酪蛋白。
表 1 实验基础饲料配方及化学组成(%干物质)Table 1. Diet formulation and chemical composition of experiment diets (% in dry matter)原料Ingredient 含量Content (%) 白鱼粉White fish meal 25.00 国产酪蛋白Domestic casein 16.50 鱼油Fish oil 3.00 玉米淀粉Corn starch 25.75 纤维素Cellulose 21.19 维生素预混物Vitamin premix1 0.45 胆碱Choline 0.11 矿物盐预混物Mineral premix2 5.00 海藻酸钠Sodium alginate 1.00 羧甲基纤维素Carboxymethyl cellulose 2.00 三氧化二钇Y2O3 0.50 饲料化学成分Chemical composition (% in dry matter) 粗蛋白Crude protein 32.96 粗脂肪Crude lipid 5.30 能量Energy (kJ/g) 14.55 注: 1. 维生素预混物Vitamin premix (mg/kg diet): 维生素B1 Thiamin, 20; 维生素B2 Riboflavin, 20; 烟酸Niacin, 100; 维生素B6 Pyridoxine, 20; 生物素Biotin, 0.1; 维生素B12 Cyanocobalamine, 0.020; 叶酸Folic acid, 5; 泛酸钙Calcium pantothenate, 50; 肌醇Inositol, 100; 维生素C Ascorbic acid, 100; 维生素A Retinol, 1.1; 维生素D Vitamin D, 20; 维生素E Vitamin E, 50; 维生素K Vitamin K, 10; 玉米淀粉Corn starch, 645.2; 2. 矿物盐预混物Mineral premix (mg/kg diet): NaCl, 500; MgSO4·7H2O, 8155.6; KH2PO4, 16000.0; Ca(HPO4)2·H2O, 7650.6; NaH2PO4·2H2O, 12500.0; FeSO4·7H2O, 2286.2; C6H10CaO6·5H2O, 1750.0; MnSO4·H2O, 61.4; ZnSO4·7H2O, 178.0; CuSO4·5H2O, 15.5; CoSO4·7H2O, 0.91; KI, 1.5; 玉米淀粉Corn starch, 753.7 在各实验组中, 通过酶联免疫法测得饲料中AFB1含量分别为0.8、11.6、20.3、94.9、955.7和4979.2 μg/kg, AFB1浓度的设计参考关于AFB1在水产动物的研究报道[4, 5, 15]。AFB1纯品购于美国Sigma公司, 将其溶于大豆油制成1000 μg/mL的母液, 按照设计浓度添加相应量到各组饲料中。饲料制成直径3 mm颗粒, 于60℃恒温干燥箱中烘干后置于−20℃冰箱备用。
1.3 实验鱼与饲养实验
实验草鱼幼鱼来自福州市闽侯县南屿汤湖生态养殖场。实验鱼在室内循环水养殖系统中暂养2周后转入实验系统驯养2周, 暂养和驯化阶段均投喂对照组饲料(表 1)。在实验开始时, 实验鱼饥饿24h, 选择健康、规格较为一致的草鱼幼鱼(平均体重2.90 g)360尾, 随机放入18个鱼缸中, 分为6个实验组, 每组3个平行, 每缸20尾, 进行为期84d的饲养实验。暂养期间和实验期间均于每日9:30与16:00分别连续投喂饲料, 达到表观饱食为止。在实验结束时, 将实验鱼饥饿24h, 称量和记录每缸鱼的终末体重。
1.4 实验取样
在实验结束时, 每缸随机取3尾草鱼幼鱼解剖取出肝胰脏和肾脏, 用中性甲醛固定, 采用HE染色做组织切片, 用作组织学观察; 每缸随机取7尾草鱼幼鱼在冰盘上解剖取背部白肌, 冷冻干燥后保存于−20℃用于肌肉AFB1含量测定。
1.5 样品的测定
实验饲料的干物质、粗蛋白、粗脂肪、灰分的测定参照文献[17]的方法测定: 干物质在105℃烘干至恒重, 通过失重法测定; 粗蛋白采用FOSS定氮仪(2300 Kjeltec Analyzer Unit)测定; 粗脂肪采用索氏抽提仪(Soxtec system HT6, Tecator, Hoganas, Sweden)进行测定; 灰分在马福炉中550℃燃烧3h, 失重法测定。
血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定均采用南京建成生物工程研究所的测试盒。鱼体肌肉毒素残留采用ELISA法[4, 15], 使用北京百灵康源生物公司的测试盒进行测定, 使用酶标仪(THERMO FISHER Multiskan FC)读数。
1.6 数据处理
利用下列公式计算特定生长率、摄食率、饲料效率、肝体比和脏体比:
存活率Survival rate (%)=100%×(剩余尾数/初始尾数)
特定生长率(SGR, %/d)=100%×(LnW2−LnW1)/t
摄食率(FR, %BW/d)=100%×I/[(W1+W2)/2]/t
饲料利用率(FE, %)=100%×(W2−W1)/I
肝体比(HSI)=l00×肝脏重量(g)/鱼体体重(g)
脏体比(VSI)=l00×内脏重量(g)/鱼体体重(g)
式中, W1为平均初始体重(g), W2为平均终末体重(g), t为实验时长(d), I为摄食量(g)。实验数据采用统计软件SPSS Statistics 17.0进行统计分析。实验结果经过一元方差分析(One-way ANOVA)后, 用Duncan’s进行多重比较, 当P<0.05时为差异显著。
2. 结果
2.1 饲料中AFB1水平对草鱼幼鱼生长的影响
在整个实验过程中, 各组草鱼幼鱼行为均未表现出异常。各毒素组草鱼幼鱼外部形态和颜色较对照无显著差别。如表 2所示, 各毒素组草鱼幼鱼的存活率均在80%以上, 与对照组无显著差异(P>0.05)。在实验结束时, 各组草鱼幼鱼终末体重无显著差异(P>0.05)。饲料AFB1水平对草鱼幼鱼摄食率(FR)、特定生长率(SGR)、饲料效率(FE)无显著影响(P>0.05)。
表 2 饲料AFB1水平对草鱼幼鱼初始体重(IBW)、终末体重(FBW)、存活率、摄食率(FR)、特定生长率(SGR)和饲料效率(FE)的影响(平均值±标准误)Table 2. Effects of dietary AFB1 on initial body weight (IBW), final body weight (FBW), survival rate, feeding rate (FR), specific growth rate (SGR), feed efficiency (FE) of juvenile grass carp (Mean±SE)AFB1添加量
Supplemented AFB1
(μg/kg diet)初始体重
IBW (g)终末体重
FBW (g)存活率
Survival rate (%)摄食率
FR (%BW/d)特定生长率
SGR (%/d)饲料效率
FE (%)0 2.90±0.20 22.97±0.57 86.7±4.4 2.89±0.02 2.46±0.07 63.8±0.5 10 2.90±0.10 24.53±1.59 87.0±7.6 2.81±0.14 2.54±0.06 66.9±3.8 20 2.90±0.20 24.73±2.73 88.4±2.5 2.85±0.22 2.56±0.06 66.5±5.9 100 2.90±0.26 23.47±0.85 84.1±2.5 2.83±0.12 2.49±0.07 65.7±2.8 1000 2.90±0.20 24.03±1.46 84.1±6.6 2.87±0.08 2.52±0.06 65.1±1.7 5000 2.93±0.11 25.27±1.90 87.0±4.4 2.83±0.12 2.57±0.13 66.7±3.9 2.2 饲料AFB1水平对草鱼幼鱼生理指标的影响
如表 3所示, 饲料AFB1水平对草鱼幼鱼血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性均无显著影响(P>0.05)。
表 3 饲料AFB1水平对草鱼幼鱼血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响(平均值±标准误)Table 3. Effects of dietary AFB1 on serum activities of glutamic-pyruvic transaminase (ALT), glutamic-oxalacetic transaminase (AST), alkaline phosphatase (ALP), superoxide dismutase (SOD), and glutathione peroxidase (GSH-Px) of juvenile grass carp (Mean± SE)AFB1添加量
Supplemented AFB1 (μg/kg diet)ALT (U/L) AST (U/L) ALP (U/L) SOD (U/L) GSH-Px (U/L) 0 12.5±0.4 30.3±2.3 5.36±0.79 169.9±19.5 269.4±9.4 10 11.8±1.1 28.3±4.8 5.75±0.85 188.6±11.0 266.8±13.3 20 11.9±1.0 29.7±4.0 5.52±0.56 162.5±24.2 283.3±11.9 100 12.4±1.7 28.1±3.5 5.71±0.64 169.6±21.0 265.6±12.7 1000 13.1±0.6 28.3±2.7 5.69±1.25 171.9±10.4 274.9±9.6 5000 11.8±0.9 28.4±1.8 5.60±0.62 165.2±13.2 267.0±8.1 2.3 饲料中AFB1水平对草鱼幼鱼内脏指数和组织学的影响
经过为期84d含不同浓度AFB1的饲料饲养后, 解剖发现, 草鱼幼鱼皮肤和各组织完整, 未观察到鳍、眼和内脏器官等外部形态的改变。各毒素组幼鱼的肝体比和脏体比与对照组相比无显著差异(P>0.05, 表 4)。
表 4 饲料中AFB1水平对草鱼幼鱼肝体比(HSI)、脏体比(VSI)的影响(平均值±标准误)Table 4. Effects of dietary AFB1 on hepatosomatic index (HSI) and viscera index (VSI) of juvenile grass carp (Mean ± SE)AFB1添加量
Supplemented AFB1 (μg/kg diet)肝体比
HSI脏体比
VSI0 1.80±0.04 8.27±0.47 10 1.77±0.10 7.57±0.75 20 1.76±0.07 7.73±0.99 100 1.76±0.08 7.63±0.40 1000 1.72±0.11 7.43±0.75 5000 1.73±0.19 7.25±0.33 肝脏组织切片观察结果如图 1所示, 摄入不同浓度AFB1的草鱼幼鱼肝细胞均未出现异常, 细胞膜完整, 细胞质均匀、清晰, 细胞核形状较为规则, 细胞紧密连接。未见各类炎症细胞, 没有嗜酸性粒细胞聚集现象。图 2为肾脏组织切片观察结果, 经不同AFB1浓度处理的草鱼幼鱼肾脏组织未出现异常, 组织细胞边界清晰, 肾小管与周围组织相连, 未出现萎缩、变形等病理变化, 各毒素组草鱼幼鱼肾脏组织结构与对照组无显著差异。
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图 1 饲料中AFB1对草鱼幼鱼肝脏组织学的影响(HE, 标尺为50 μm)Figure 1. Hepatopancreas of juvenile grass carp fed with diets containing AFB1 (HE, Bar = 50 μm)![]()
图 2 饲料中AFB1对草鱼幼鱼肾脏组织学的影响(HE, 标尺为50 μm)Figure 2. Kidney of juvenile grass carp fed with diets containing AFB1 (H&E, Bar = 50 μm)2.4 饲料AFB1水平对草鱼幼鱼肌肉的AFB1积累水平的影响
在实验结束时, 草鱼幼鱼肌肉中AFB1的残留量如表 5所示。摄食AFB1≤1000 μg/kg的草鱼幼鱼肌肉中未检测出AFB1残留, 仅在5000 μg/kg实验组中检测出肌肉中含有(1.21±0.18) μg/kg的AFB1。
表 5 饲料中AFB1水平对草鱼幼鱼肌肉AFB1积累(μg/kg湿重)的影响(平均值±标准误)Table 5. Effects of dietary AFB1 on AFB1 accumulation (μg/kg wet weight) in muscle of juvenile grass carp (Mean± SE)AFB1添加量
Supplemented AFB1
(μg/kg diet)肌肉AFB1积累量AFB1
accumulation in muscle
(μg/kg diet)0 未检出 10 未检出 20 未检出 100 未检出 1000 未检出 5000 1.21±0.18 3. 讨论
3.1 饲料中AFB1水平对草鱼幼鱼存活率和生长的影响
AFB1会引起水产动物行为异常、体表黄化、食欲降低, 长期食用或暴露在AFB1污染中还会表现出致癌、致畸、致突变等基因毒性, 造成动物死亡[4, 18－20]。凡纳滨对虾摄入AFB1含量为 1500 μg/kg的饲料后成活率显著下降[21]。罗非鱼摄食AFB1含量为10 mg/kg的饲料对死亡率无显著影响[5]。异育银鲫摄食1000 μg/kg AFB1后存活率与对照组无显著差异[1]。在本实验中, 草鱼幼鱼摄入AFB1达5000 μg/kg的饲料对存活率无显著影响, 形态正常、鱼体健康, 表明草鱼幼鱼对AFB1的耐受性较强。
尼罗罗非鱼[14]、斑节对虾(Penaeus monodon Fabricius)[22]摄食AFB1后表现为增重率降低; 沟鲶[19]和杂交鲟(Acipenser ruthenus ♀×A. baerii ♂)[23]摄食AFB1后摄食率下降。罗非鱼摄食AFB1达245 μg/kg时饲料效率显著降低, 饲料效率降低与饲料中AFB1含量存在剂量效应[4]。在本实验中, 各毒素组草鱼幼鱼摄食率、特定生长率、饲料效率均未显著受到显著影响, 表明不同的鱼类在AFB1的耐受性上差别很大。
3.2 饲料中AFB1水平对草鱼幼鱼肝功能指标和抗氧化能力的影响
肝脏被认为是AFB1的主要作用器官。AFB1在肝脏中首先经细胞色素P450氧化酶代谢转化为黄曲霉毒醇(AFL)等, 而黄曲霉毒醇又转化为AFB1-8,9-环氧化合物(AFBO), 随后与鸟嘌呤结合, 形成一系列的加成物导致可遗传的恶性肿瘤基因[24]。生物体血清中的AST和ALT是医学临床上肝功能检查的最为主要的2种指标, 当肝脏受损, 细胞膜的通透性增大, 存在于肝细胞浆ALT和AST进入血液内, 血清中的ALT和AST的活性升高[1, 4, 11]。凡纳滨对虾摄入AFB1后ALT和AST活力显著高于对照组[25]。碱性磷酸酶是肝脏中重要的解毒酶, 也是肝脏受损的评价标准之一。斑节对虾摄食AFB1后ALP活性显著升高[22]。在本实验中, 草鱼幼鱼摄入不同浓度AFB1后血清ALT, AST和ALP均无显著变化, 说明摄食AFB1含量≤5000 μg/kg饲料未对草鱼幼鱼肝功能造成损伤。
AFB1经过生物活化步骤转化成的AFBO具有亲电性, 极易攻击酶蛋白分子上亲核的氮、氧和硫等杂原子, 不但使酶蛋白失活, 而且使体内产生的大量自由基和活性氧无法及时清除[26]。肝细胞自由基清除系统受损, 机体的抗氧化能力大大降低, 从而引起组织细胞的脂质过氧化, 使细胞内活性氧防卫系统SOD、GSH-Px等活力下降[11]。在本实验中, 摄食AFB1未对草鱼幼鱼的SOD和GSH-Px造成显著影响。
3.3 饲料中AFB1水平对草鱼幼鱼内脏指数和组织学的影响
AFT可引起动物肝脏纤维化、肝小叶中心坏死, 胆囊肿大、胆管上皮组织增生等。摄入AFB1会造成鱼体肝脏肿大, 肝体比显著升高[20]。在本实验中, 草鱼摄食AFB1达5000 μg/kg饲料对肝体比、脏体比无显著影响, 未造成胆囊肿大, 此结果与Huang等[15]对异育银鲫的报道相似。
虹鳟连续12个月摄入80 μg/kg的AFB1后, 肝脏表现为出现大量空泡并伴有炎症反应[27]。在肝脏受损的情况下, 虹鳟的原纤维细胞会转化为成肌纤维细胞, 以应对肝脏的损伤。罗非鱼摄入超过245 μg/kg超过20W后会引起肝脏疾病, 表现为肝形态异常, 肝脏空泡化严重, 伴有大量的嗜酸性粒细胞和炎症细胞[4]。凡纳滨对虾摄入AFB1后肝胰腺出现空泡的数量要远多于对照组, 随着AFB1浓度的升高, 肝细胞坏死程度越深, 空泡数量越多[11]。虹鳟摄食0.5 μg AFB1/kg饲料6个月后发现肝癌[8]。在本实验中, 草鱼幼鱼的肝胰脏组织未呈现纤维化病变, 肝脏细胞排列正常、紧密, 未见各类炎症细胞, 表明食用5000 μg/kg以下的AFB1不会对草鱼幼鱼肝胰脏造成病理损伤, 该结果与Han等[28]异育银鲫摄入AFB1后肝胰脏组织结构的影响的报道相似。这些不同的研究结果表明, AFB1诱导肝癌的易感性方面, 生物种间存在着极大的差异。
鲤(Cyprinus carpio)摄食不同浓度(0.5、0.7、1.4 mg/kg) AFB121d, 鲤肾脏上皮组织变性脱落、坏死, 肾小管和肾小囊腔扩张[29]。AFB1急性或者亚急性攻毒均会引起南亚野鲮肾脏肾曲小管上皮细胞变性、坏死, 肾小球萎缩[30]。低浓度(0.05 μg/kg) AFB1饲料饲养白鼠8周, 解剖观察其肾脏组织学变化, 染毒组的小鼠肾脏部分区域的近曲小管出现坏死和脱落现象; 电镜结果表明, 细胞质呈现空泡状态, 缺乏线粒体, 微绒毛间隔稀疏, 远曲小管出现细胞极性的消失和基底外侧内折[31]。在本实验中, 草鱼摄入5000 μg/kg以下的AFB1不会对肾脏组织造成损伤, 表明草鱼可能对AFB1有较强的代谢能力。一些鱼类对AFB1耐受力较强可能是由于AFB1在其体内较快地转化成AFL而非AFBO, 并且迅速被解毒酶作用而生成水溶性物质, 最后通过其胆汁、尿液等排出体外[12]。
3.4 饲料AFB1水平对草鱼幼鱼肌肉的AFB1积累水平的影响
用不同浓度AFB1饲料饲喂罗非鱼, 仅在肝脏中可以检测出AFB1的残留, 肌肉中未能测出[32]。用不同浓度AFB1饲喂异育银鲫24周, 各组异育银鲫的肌肉中测出的AFB1残留量小于5 μg/kg, 低于FDA规定的食品中AFB1含量限量标准[33]。海鲈(Dicentrarchus labrax L.)饲喂含18 μg/kg AFB1饲料42d后, 其肌肉中的AFB1达到4.25 μg/kg[34]。斑节对虾摄入AFB1第4周肌肉和头胸甲中有残留, 且肌肉中含量多余头胸甲, 而第6周开始AFB1的残留量开始下降, 肌肉中AFB1含量极低, 而头胸甲中的残留量也显著减小[22]。在本研究中, 摄入AFB1浓度在1000 μg/kg以下的草鱼肌肉中未检测出AFB1残留, 而5000 μg/kg组的残留量仅为1.21 μg/kg, 低于FDA食品安全标准, 此结果与王静等[11]对凡纳滨对虾的报道相似, 摄入AFB1含量在2000 μg/kg以下的虾体肌肉中未检测出AFB1。
4. 结论
草鱼幼鱼摄入AFB1含量达4979.2 μg/kg饲料84d后, 其生长、肝功能指标、内脏指数、肝胰脏和肾脏组织结构均未受到显著影响。肌肉的AFB1残留量低于FDA食品安全限定标准。
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图 1 饲料中AFB1对草鱼幼鱼肝脏组织学的影响(HE, 标尺为50 μm)
Figure 1. Hepatopancreas of juvenile grass carp fed with diets containing AFB1 (HE, Bar = 50 μm)
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图 2 饲料中AFB1对草鱼幼鱼肾脏组织学的影响(HE, 标尺为50 μm)
Figure 2. Kidney of juvenile grass carp fed with diets containing AFB1 (H&E, Bar = 50 μm)
表 1 实验基础饲料配方及化学组成(%干物质)
Table 1 Diet formulation and chemical composition of experiment diets (% in dry matter)
原料Ingredient 含量Content (%) 白鱼粉White fish meal 25.00 国产酪蛋白Domestic casein 16.50 鱼油Fish oil 3.00 玉米淀粉Corn starch 25.75 纤维素Cellulose 21.19 维生素预混物Vitamin premix1 0.45 胆碱Choline 0.11 矿物盐预混物Mineral premix2 5.00 海藻酸钠Sodium alginate 1.00 羧甲基纤维素Carboxymethyl cellulose 2.00 三氧化二钇Y2O3 0.50 饲料化学成分Chemical composition (% in dry matter) 粗蛋白Crude protein 32.96 粗脂肪Crude lipid 5.30 能量Energy (kJ/g) 14.55 注: 1. 维生素预混物Vitamin premix (mg/kg diet): 维生素B1 Thiamin, 20; 维生素B2 Riboflavin, 20; 烟酸Niacin, 100; 维生素B6 Pyridoxine, 20; 生物素Biotin, 0.1; 维生素B12 Cyanocobalamine, 0.020; 叶酸Folic acid, 5; 泛酸钙Calcium pantothenate, 50; 肌醇Inositol, 100; 维生素C Ascorbic acid, 100; 维生素A Retinol, 1.1; 维生素D Vitamin D, 20; 维生素E Vitamin E, 50; 维生素K Vitamin K, 10; 玉米淀粉Corn starch, 645.2; 2. 矿物盐预混物Mineral premix (mg/kg diet): NaCl, 500; MgSO4·7H2O, 8155.6; KH2PO4, 16000.0; Ca(HPO4)2·H2O, 7650.6; NaH2PO4·2H2O, 12500.0; FeSO4·7H2O, 2286.2; C6H10CaO6·5H2O, 1750.0; MnSO4·H2O, 61.4; ZnSO4·7H2O, 178.0; CuSO4·5H2O, 15.5; CoSO4·7H2O, 0.91; KI, 1.5; 玉米淀粉Corn starch, 753.7 
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表 2 饲料AFB1水平对草鱼幼鱼初始体重(IBW)、终末体重(FBW)、存活率、摄食率(FR)、特定生长率(SGR)和饲料效率(FE)的影响(平均值±标准误)
Table 2 Effects of dietary AFB1 on initial body weight (IBW), final body weight (FBW), survival rate, feeding rate (FR), specific growth rate (SGR), feed efficiency (FE) of juvenile grass carp (Mean±SE)
AFB1添加量
Supplemented AFB1
(μg/kg diet)初始体重
IBW (g)终末体重
FBW (g)存活率
Survival rate (%)摄食率
FR (%BW/d)特定生长率
SGR (%/d)饲料效率
FE (%)0 2.90±0.20 22.97±0.57 86.7±4.4 2.89±0.02 2.46±0.07 63.8±0.5 10 2.90±0.10 24.53±1.59 87.0±7.6 2.81±0.14 2.54±0.06 66.9±3.8 20 2.90±0.20 24.73±2.73 88.4±2.5 2.85±0.22 2.56±0.06 66.5±5.9 100 2.90±0.26 23.47±0.85 84.1±2.5 2.83±0.12 2.49±0.07 65.7±2.8 1000 2.90±0.20 24.03±1.46 84.1±6.6 2.87±0.08 2.52±0.06 65.1±1.7 5000 2.93±0.11 25.27±1.90 87.0±4.4 2.83±0.12 2.57±0.13 66.7±3.9
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表 3 饲料AFB1水平对草鱼幼鱼血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响(平均值±标准误)
Table 3 Effects of dietary AFB1 on serum activities of glutamic-pyruvic transaminase (ALT), glutamic-oxalacetic transaminase (AST), alkaline phosphatase (ALP), superoxide dismutase (SOD), and glutathione peroxidase (GSH-Px) of juvenile grass carp (Mean± SE)
AFB1添加量
Supplemented AFB1 (μg/kg diet)ALT (U/L) AST (U/L) ALP (U/L) SOD (U/L) GSH-Px (U/L) 0 12.5±0.4 30.3±2.3 5.36±0.79 169.9±19.5 269.4±9.4 10 11.8±1.1 28.3±4.8 5.75±0.85 188.6±11.0 266.8±13.3 20 11.9±1.0 29.7±4.0 5.52±0.56 162.5±24.2 283.3±11.9 100 12.4±1.7 28.1±3.5 5.71±0.64 169.6±21.0 265.6±12.7 1000 13.1±0.6 28.3±2.7 5.69±1.25 171.9±10.4 274.9±9.6 5000 11.8±0.9 28.4±1.8 5.60±0.62 165.2±13.2 267.0±8.1
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表 4 饲料中AFB1水平对草鱼幼鱼肝体比(HSI)、脏体比(VSI)的影响(平均值±标准误)
Table 4 Effects of dietary AFB1 on hepatosomatic index (HSI) and viscera index (VSI) of juvenile grass carp (Mean ± SE)
AFB1添加量
Supplemented AFB1 (μg/kg diet)肝体比
HSI脏体比
VSI0 1.80±0.04 8.27±0.47 10 1.77±0.10 7.57±0.75 20 1.76±0.07 7.73±0.99 100 1.76±0.08 7.63±0.40 1000 1.72±0.11 7.43±0.75 5000 1.73±0.19 7.25±0.33
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表 5 饲料中AFB1水平对草鱼幼鱼肌肉AFB1积累(μg/kg湿重)的影响(平均值±标准误)
Table 5 Effects of dietary AFB1 on AFB1 accumulation (μg/kg wet weight) in muscle of juvenile grass carp (Mean± SE)
AFB1添加量
Supplemented AFB1
(μg/kg diet)肌肉AFB1积累量AFB1
accumulation in muscle
(μg/kg diet)0 未检出 10 未检出 20 未检出 100 未检出 1000 未检出 5000 1.21±0.18
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