MOLECULAR CHARACTERIZATION, TISSUE DISTRIBUTION AND TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF LYSOSOMAL ACID LIPASE (LAL) IN YELLOW CATFISH (PELTEOBAGRUS FULVIDRACO)
-
摘要: 通过分子结构、组织表达及启动子结构功能分析, 探讨黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)溶酶体酸性脂肪酶(Lysosmal acid lipase, lal)基因的分子特征及转录调控, 为lal在鱼类脂质代谢和转录水平的调控提供新的视野。实验采用RT-PCR和RACE克隆lal基因的cDNA全长序列, 其长度为1802 bp, 5′上游启动子长度为2052 bp, 其中ORF长度为1197 bp, 编码398个氨基酸, 理论蛋白分子量大小为45.42 kD, 等电点为7.70, 含有23个残基的信号肽、5个糖基化位点(Asn35-Ile36-Ser37、Asn101-Thr102-Ser103、Asn273-Met274-Thr275、Asn320-Gln321-Ser322、Lys161-Thr162-Thr163)、3个半胱氨酸(Cys257、Cys265、Cys284)、催化三元体(Ser174、Asp344、His373)、一个“帽子”(Thr205-Val329)和一个“盖子”(Phe233-Leu272)结构域。氨基酸序列对比和系统发育树分析显示, 黄颡鱼的lal与斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)亲缘关系最近。组织表达分析显示, lal基因的mRNA在脾脏、肠和精巢表达量最高。黄颡鱼lal启动子上存在Sp1、STAT3、PPARα、FOXO1、PPARγ及HNF4α等转录位点, 启动子活性实验表明, –1507 bp/–1016 bp区域负调控启动子活性, –1016 bp/+51 bp区域正调控启动子活性。研究对黄颡鱼溶酶体酸性脂肪酶(lal)基因序列的分子特征进行了解析, 有助于了解鱼类lal的结构和功能, 为进一步研究鱼类脂质代谢的调控机制奠定基础。Abstract: Nowadays, fatty liver and visceral excessive lipid accumulation are common in cultured fish, which reduces survival rate, growth performance and disease resistance. Yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco is widely distributed in rivers, lakes and other fresh waters in China, and cultured in China and several Asian countries. The fish has relatively high economic value because of delicious taste and abundant nutrition. However, due to intensive culture and improper feeding, excessive fat accumulation in abdominal cavity and liver commonly occurs, which seriously affects the taste and health of yellow catfish. Therefore, the research on fat metabolism of yellow catfish has always been the focus. Lysosomal acid lipase (LAL), encoded by LIPA, hydrolyzes cholesterylesters (CEs) and triglycerides (TGs) to cholesterol and free fatty acids (FFAs), which are then used for metabolic purposes in the cells. The studies have been conducted to explore lal structure in mammals, but were scarce in fish. For this reason, it is important to study the molecular characteristics of lal in the regulation of lipid metabolism of yellow catfish. In this study, we analyzed molecular structure, tissue expression, promoter structure and function, and transcriptional regulation of lal. The lal gene was amplified from yellow catfish by RT-PCR and RACE approaches. The cDNAs of lal was 1802 bp, encoding a peptide of 398 amino acid residues, and 5′ upstream promoter was 2052 bp in length. The molecular weight of the theoretical protein was 45.42 kDa, the isoelectric point was 7.70, and it had a signal peptide with 23 residues, five glycosylation sites, three cysteines, a catalytic ternary and a “cap” domain and a “lid” region. The amino acid alignment and phylogenetic analysis revealed that lal of P. fulvidraco was closely related to that of Ictalurus punctatus. The lal mRNA was expressed in all tested tissues (heart, liver, brain, spleen, kidney, muscle, fat, intestine, testis and ovary), with the highest expression levels in spleen, intestine and testis. Promoter sequence analysis revealed several transcription factor binding sites in lal promoter, such as Sp1, STAT3, PPARα, FOXO1, PPARγ, and HNF4α. Studies on promoter activity showed that –1507/–1016 region negatively regulated promoter activity, while –1016/+51 region positively regulated promoter activity. The present study indicated that lal mRNA was expressed in multiple high metabolism tissues. The transcription of lal was regulated by multiple transcription factors. This study help us to understand the structure and function of lal, and lay a foundation for further research on the regulatory mechanism of lipid metabolism in fish.
-
目前, 养殖鱼类普遍存在脂肪肝、内脏脂质过多和相关代谢紊乱的问题, 导致成活率下降、生长性能下降和抗病性下降等[1]。在脂肪分解中除了中性脂肪酶介导的脂解外, 溶酶体酸性脂肪酶(Lysosmal acid lipase, LAL)承担着重要脂解功能。lal作为溶酶体中的酸性脂肪酶, 由LIPA基因编码, 主要作用是将胆固醇酯(Cholesteryl esters, CEs)和甘油三酯(Triglycerides, TGs)水解成游离的胆固醇(Free cholesterols, FCs)和脂肪酸(Free fatty acids, FFAs)[2]。而lal在脂解反应中, 除了水解由低密度脂蛋白(Low density lipoprotein, LDL)内吞进入胞质内的CEs、TGs和REs (Retinyl esters, REs)以外[3], 还通过自噬分解脂滴[4]。人的LAL由372个氨基酸组成含有27个残基的疏水信号肽[5]、6个N-糖基化位点[6], 并且通过与高尔基体中甘露糖-6-磷酸受体结合, 靶向溶酶体发挥其生理作用[7]。目前有关LAL的研究多集中于哺乳动物的分子结构[5]、LIPA基因突变或缺失导致脂肪沉积、肝脏病变[8]、免疫机能下降[9]和冠状动脉疾病[10]等, 而有关lal在鱼类生长发育和生理营养过程中所起到的作用尚不清楚。
黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)肉质细嫩、耐低温, 是我国重要的淡水经济养殖鱼类, 其养殖产量逐年增加[11]。鉴于lal对脂质代谢的重要作用, 为深入解析lal功能, 本实验首先克隆黄颡鱼lal基因全长的cDNA序列, 进行生物信息学分析并探讨其组织表达模式, 然后从启动子结构及活性分析研究黄颡鱼lal的转录调控方式, 以期为深入解析黄颡鱼lal基因的功能奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试验鱼及样品采集
本实验的黄颡鱼分为2组, 购自武汉市农贸市场。黄颡鱼样品采集参照本实验室的方法[12]。第一组黄颡鱼, 取肝脏和卵巢组织用于lal基因cDNA全长序列的克隆, 取肝脏、脾脏、肾脏、肠道、肠系膜脂肪、肌肉、大脑、心脏和性腺组织用于组织表达水平的测定。第二组黄颡鱼用于lal基因的启动子克隆, 取样参照本实验室的方法[13], 随机选取黄颡鱼3尾, 麻醉后冰浴上迅速剪取尾鳍进行总DNA提取。
1.2 实验材料
凝胶回收试剂盒购自Omega公司; TRIzol总RNA提取试剂盒、胰蛋白酶、DNA提取试剂盒、Lipo2000转染试剂盒、DMEM培养基和新生胎牛血清(FBS)等购自Invitrogen公司; 其他分子试剂均购自TaKaRa公司; 化学试剂均为分析纯, 购自上海国药; 胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、大肠杆菌DH5α感受态细胞和氨苄青霉素等购自武汉迪跃创新生物有限公司。HEK293T细胞株来自华中农业大学水产学院细胞资源中心。
1.3 黄颡鱼lal基因cDNA序列的克隆及测序
根据本实验室已有的方法[12], 参照Invitrogen的TRIzol说明书进行总RNA的提取。1%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop ND-2000分光光度计检测总RNA的质量和纯度。用TaKaRa的反转录试剂盒(PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit)进行反转录。
根据GenBank数据库中已报道的黄颡鱼lal基因序列, 用Premier 5.0分别设计3′和5′ RACE特异性引物(表 1), 通过巢式PCR反应进行末端的扩增, 第一轮PCR反应参数: 95℃ 5min; 然后95℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 1min, 25个循环; 72℃ 5min。第二轮PCR反应参数: 95℃ 3min; 95℃ 30s, 57℃ 30s, 72℃ 1min, 30个循环; 最后72℃ 5min。
表 1 黄颡鱼lal基因cDNA全长序列的克隆及荧光定量所用的引物Table 1. Primers used for lal cDNA cloning and PCR引物Primer 核苷酸序列Sequence (5′—3′) 3′-lal-O AATCAGTCAACCCCTCCAT 3′-lal-I CTGGGAGCACCTGGACTTC 5′-lal-O CAGGCTTAGGCTCTGCTT 5′-lal-I AGGCTCTGCTTCTTGGA lal-F GTTCGAGGTGGTCACTGAGG lal-R CTGGTGTTGGGAAGGTTGGT β-actin-F GCACAGTAAAGGCGTTGTGA β-actin-R ACATCTGCTGGAAGGTGGAC ubce-F TCAAGAAGAGCCAGTGGAGG ubce-R TAGGGGTAGTCGATGGGGAA rpl-7-F GGCAAATGTACAGGAGCGAG rpl-7-R GCCTTGTTGAGCTTGACGAA gapdh-F TTTCAGCGAGAGAGACCCAG gapdh-R ATGACTCTCTTGGCACCTCC 1.4 序列分析
用Seqman软件将扩增得到的核心片段、3′ 和5′ 末端序列拼接, 从而获得基因cDNA全长。利用NCBI进行BLAST, 以确定该序列对应的基因亚型(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。同时, 利用NCBI中ORF finder软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)找出开放阅读框(ORF)并翻译成氨基酸序列。信号肽用Signal 5.0在线软性预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 通过在线软件Expasy(https://web.expasy.org/compute_pi/)预测蛋白分子量大小及等电点, NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)分析N-糖基化位点, 使用Clustal-W软件进行序列比对和氨基酸同源性分析。用MEGA 5.0软件采用邻接法(NJ) 构建进化树[14], 选择的最适进化模型为JTT+G[15], 每个节点的可信值进行1000次重复计算。
1.5 黄颡鱼LAL三维结构模型分析
利用SWISS-MODEL同源蛋白建模构建黄颡鱼LAL蛋白质的三维模型, 选择狗的胃脂肪酶(PDB code 1k8q.1)[16]作为合适的结构模板, 其中两者序列一致度达到56.84%。用VMD 1.9.2(https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/)显示和分析得到蛋白单体的理论模型。
1.6 黄颡鱼lal基因的组织表达分析
参照文献[12], 利用实时荧光定量PCR(q-PCR)方法检测lal基因在黄颡鱼不同组织中的表达。q-PCR反应参数: 95℃ 30s; 95℃ 5s, 57℃ 30s, 72℃ 30s, 40个循环。选用β-actin和ubce作为内参基因, 相对表达水平采用2–∆∆Ct方法计算[17]。荧光定量引物见表 1。
1.7 黄颡鱼lal基因启动子的克隆及质粒构建
利用RNA连接酶介导的5′ cDNA末端快速扩增(RLM-5′ RACE)方法鉴定黄颡鱼lal的5′ cDNA序列和转录起始位点(Transcription start sites, TSS)。启动子克隆是基于上一步得到的5′末端的DNA序列及已发表的黄颡鱼[18]的基因组, 实验过程参照本实验室已有的方法[13]。利用Omega试剂盒从黄颡鱼尾鳍中提取基因组DNA, 并设计具有酶切位点的特异性引物(表 2), 将PCR产物和pGL3-Basic质粒纯化并使用相应的内切酶(Hind Ⅲ和SacⅠ)消化, 重组连接按照ClonExpressTM Ⅱ One Step Cloning Kit说明书操作。简要操作步骤如下: 第一轮进行RT-PCR反应: 95℃ 3min; 95℃ 15s, 57℃ 15s, 72℃ 50s, 35个循环; 72℃ 3min。以第一轮PCR产物为模板, 加入含有酶切位点的引物进行第二轮PCR: 95℃ 3min; 95℃ 15s, 55℃ 30s, 72℃ 2min, 35个循环; 72℃ 3min, 获得对应的目的片段。将目的片段与pGL-3载体连接30min后, 转化至DH5α感受态细胞中, 氨苄抗性平板筛选出阳性克隆, 送北京擎科生物科技有限公司测序。将测序后返还的质粒重新转化后, 进行扩大培养和质粒抽提。质粒抽提方法参照说明书进行。本实验共构建4个黄颡鱼lal启动子缺失载体, 分别命名为pGL3-554/+51、pGL3-1016/+51、pGL3-1567/+51和pGL3-2052/+51。
表 2 黄颡鱼lal cDNA启动子克隆所用到的引物Table 2. Primers used for lal promoter cloning of P. fulvidraco引物Primer 核苷酸序列Sequence (5′—3′) RT-PCR-F CTGAGCACCGAGATCCAC RT-PCR-R TAATAATCCCGCCTTCTC pGL3-554/+51 F ctatcgataggtaccgagctcTCCCCTCGCCTTGTCCCA pGL3-554/+51 R cagtaccggaatgccaagcttTAATAATCCCGCCTTCTCTATTACG pGL3-1016/+51 F ctatcgataggtaccgagctcTTCAAATTACAACCAGCCAAAGC pGL3-1016/+51 R cagtaccggaatgccaagcttTAATAATCCCGCCTTCTCTATTACG pGL3-1567/+51 F ctatcgataggtaccgagctcCACACTTTAATATACATGTACTATACATCACCT pGL3-1567/+51 R cagtaccggaatgccaagcttTAATAATCCCGCCTTCTCTATTACG pGL3-2052/+51 F ctatcgataggtaccgagctcCTTCCCCCTGGAACATGCA pGL3-2052/+51 R cagtaccggaatgccaagcttTAATAATCCCGCCTTCTCTATTACG 利用JASPAR数据库(http://jaspar.genereg.net/)预测黄颡鱼lal启动子可能的转录因子结合位点。
1.8 细胞转染及双荧光素酶活性检测
HEK293T细胞在10% FBS-DMEM培养基中生长, 并置于37℃、5% CO2的环境中培养。瞬时转染前, 将HEK293T细胞以1.2×105的密度接种于24孔细胞培养板中, 培养24h, 需达到70%—80%的密度。使用LipofectamineTM 2000将450 ng构建好的质粒和20 ng pRL-TK(内参质粒)共转染到HEK293T细胞中, 阴性对照为pGL3-Basic质粒。4h后, 更换含有10% FBS-DMEM培养基。24h后收集细胞, 进行双荧光素酶活性检测, 检测步骤参照说明书进行。
1.9 数据统计与分析
采用平均值±标准误(mean±SE)表示结果。统计分析之前, 采用Kolmogorov-Smirnov检验所有数据的正态分布性。利用SPSS 19.0软件采用单因素方差分析和Duncan’s多重比较评估组织分布数据, 采用Student’s t test评估双荧光活性数据中相邻两组之间的差异。显著性水平为P<0.05, 极显著性水平为P<0.01。
2. 结果
2.1 黄颡鱼lal cDNA的序列特征及进化分析
本研究通过RT-PCR和RACE方法获取lal基因的cDNA全长序列, 长度为1802 bp, 序列分析显示它们的5′非翻译区长度为131 bp, 3′非翻译区长度为474 bp, cDNA序列ORF长度为1197 bp, 编码398个氨基酸, 理论蛋白分子量为45.42 kD, 等电点为7.70。黄颡鱼LAL蛋白序列含有一段具有23个氨基酸残基的信号肽、α/β水解酶折叠类结构域, 5个N-糖基化位点(Asn35-Ile36-Ser37、Asn101-Thr102-Ser103、Asn273-Met274-Thr275、Asn320-Gln321-Ser322和Lys161-Thr162-Thr163)、2个氧阴离子孔(Leu89和Gln175)、1个“帽子”结构域(Thr205-Val329)和“盖子”结构域(Phe233-Leu272), 及催化三元体(Ser174、Asp344和His373)和三个半胱氨酸残基(Cys257、Cys265和Cys284)。根据以上主要位点绘制出黄颡鱼LAL的氨基酸结构示意图(图 1)。
多重序列比显示, 黄颡鱼LAL氨基酸序列与斑点叉尾鮰相应氨基酸序列的相似性为85.64%, 与哺乳类的相似性为57.66%—62.77%, 其中与人的相似性为60.83%, 与大鼠的相似性为57.66%。
在进化树中, 哺乳类和两栖类聚为一支, 硬骨鱼独立聚为另一支(图 2)。同时在硬骨鱼类中, 黄颡鱼lal多肽与斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)亲缘关系最近, 且这两2个物种与水金线鲃(Sinocyclocheilus anshuiensis)、犀角金线魮(Sinocyclocheilus rhinocerous)和金鱼(Carassius auratus)聚为一支, 其他硬骨鱼类聚为另一支。
![]()
图 2 基于NJ法构建的脊椎动物LAL氨基酸序列的系统进化树节点上数字表示置信度, Bootstrap检验的重复次数为1000次Figure 2. The neighbor-joining phylogenetic tree based on the amino acid sequences from P. fulvidraco (▲) and other vertebrate species, using MEGA 5.0 with 1000 bootstrap replicatesThe numbers on the node indicates the confidence2.2 黄颡鱼LAL蛋白三级结构分析
LAL的三维结构主要由3个领域组成, 包括α螺旋、β折叠及转角, 3个半胱氨酸残基Cys257、Cys265和Cys284的结合位点在LAL中相互接近(图 3)。
![]()
图 3 黄颡鱼LAL蛋白三级预测Figure 3. The three-dimensional structure prediction of LAL protein from P. fulvidraco2.3 黄颡鱼lal mRNA组织表达分析
黄颡鱼lal基因在多个组织中(心脏、肝脏、脑、脾脏、肾脏、肌肉、肠系膜脂肪、肠道和性腺)均有表达, 其中脾脏、肠道和精巢中表达最高, 表达量最低的是心脏和大脑(图 4)。
![]()
图 4 黄颡鱼lal mRNA的组织表达心(H)、肝脏(L)、大脑(B)、脾脏(S)、肾脏(K)、肌肉(M)、脂肪(F)、肠(I)、精巢(T)和卵巢(O); 相对mRNA水平通过qPCR定量, 数值(平均值±标准误, n=3)用内参基因(β-actin和ubce)标准化; 不同字母表示有显著性差异(P<0.05)Figure 4. The relative mRNA levels of P. fulvidraco lal in different tissuesHeart (H), liver (L), brain (B), spleen (S), kidney (K), muscle (M), fat (F), intestine (I), testis (T), ovary (O). The reverse transcription-quantitative PCR (qPCR) data (mean±SE, n=3) were normalized to β-actin and ubce. Different letters indicated significant difference (P<0.05)2.4 黄颡鱼lal启动子序列及活性分析
本研究克隆得到2103 bp的黄颡鱼lal序列, 并将其提交到在线转录因子数据库(JASPAR)进行序列分析。lal的5′ cDNA序列的第一个碱基为基因的转录起始位点, 其位置定义为+1。利用JASPAR (http://jaspar.genereg.net/)软件预测转录因子结合位点, 发现lal启动区存在Sp1、PPARα、FOXO1、PPARγ、HNF4α和TFEB等转录因子结合位点, 同时核心启动子结构含有TATA盒和CCAAT盒。
通过5′缺失载体构建、细胞转染及双荧光素酶活性测定, 结果显示lal的–1507/–1016区域负调控启动子活性, 而–1016 bp/+51 bp区域正调控启动子活性(图 5)。
![]()
图 5 黄颡鱼5′ lal启动子区启动子活性**表示极显著差异性, P<0.01Figure 5. 5′ unidirectional deletion analysis of the lal promoter region for P. fulvidraco**indicate extremely significant difference, P<0.013. 讨论
3.1 lal序列的分子特征及进化分析
本研究获得cDNA全长为1802 bp的黄颡鱼lal基因序列, 通过对其蛋白序列分析发现, LAL蛋白质结构拥有保守的α/β水解酶折叠类结构域, 一个活性位点(Gly172-His173-Ser174-Gln175-Gly176), 1个“帽子”结构域(Thr205-Val329)和“盖子”结构域(Phe233-Leu272), 2个氧阴离子孔(Leu89、Gln175), 催化三元体(Ser174、Asp344、His373)和3个半胱氨酸残基(Cys257、Cys265、Cys284), 及5个潜在的N-糖基化位点(Asn35-Ile36-Ser37、Asn101-Thr102-Ser103、Asn273-Met274-Thr275、Asn320-Gln321-Ser322、Lys161-Thr162-Thr163)。除此之外, LAL具有23个残基的信号肽, 能够将该蛋白输送到内质网中进行信号肽裂解和N-键糖基化[5, 19]。在本研究中, 黄颡鱼具有5个N-糖基化位点, 其中除第三个Lys161-Thr162-Thr163糖基化位点以外, 其余4个在进化上都非常保守[20]。蛋白质的N-糖基化是一种新生肽链的共翻译或翻译后修饰方式, 对膜和分泌蛋白的折叠和稳定性调节具有重要意义[21]。其中, 由Asn-X-Thr/Ser组成的N-糖基化位点[22], 这3种氨基酸与高尔基体中甘露糖-6-磷酸结合, 能够识别出溶酶体表面的特定甘露糖受体[23]。当N-糖基化位点中Asn273发生突变时, LAL活性完全丧失[19], 这表明糖基化位点对LAL的功能、定位及活性至关重要。负责酶活性的催化三元体(Ser174、Asp344和His373)有2个位于蛋白质的C-末端区域, 当2个等位基因都存在时, 几乎所有的无义突变都会导致溶酶体酸性脂肪酶缺乏(Lysosomal acid lipase deficiency, LALD)[24]。在人的LAL蛋白质序列中, 半胱氨酸残基有助于提高LAL对底物的选择活性[25], 而人与黄颡鱼半胱氨酸数目不同, 可能由于物种的差异性。此外, 我们还发现黄颡鱼LAL氨基酸序列上存在一个“帽子”结构域和“盖子”结构域, Rajamohan等[26]认为“盖子”结构域打开, LAL活性被激活, 同时移动“盖子”, 使底物接近催化三元体Ser174[16]。Holmes等[27]认为来自灵长类等近亲物种的LAL半胱氨酸残基显示出高度的序列一致性, 在我们的进化树分析中, 黄颡鱼lal与其他硬骨鱼类聚为聚为一只, 哺乳动物聚为另一大分支。
3.2 LAL蛋白三级结构分析
利用已知的脂肪酶结构模型来预测LAL的三级结构, 通过三级同源模型揭示了LAL结构的保守性[23, 28], 我们的研究也显示LAL和dGL之间具有较高的氨基酸序列相似度(56.84%), 这使得基于dGL结构构建LAL的三级结构模型具有一定的现实意义。同时, Ataya[23]预测LAL的三级结构中带负电荷的Asp344与His373和Ser174形成氢键网络, 激活丝氨酸羟基。该结构隐藏在由Gln175和Leu89主链的NH基团组成的氧阴离子孔中, 它们通过形成2个短氢键为催化反应的过渡态提供了稳定的环境[29]。
3.3 lal序列的组织表达模式
了解基因的生理功能可以通过组织分布模式分析。本研究发现, 黄颡鱼lal基因在各组织中均有表达, 但在脾脏、肠道和精巢中高表达, 心脏和大脑表达量最低, 这与其他研究报道相同[30]。另外Ataya认为[23]lal在精巢中高表达的原因, 可能是由于精巢组织分裂活跃, 精子细胞膜脂双层的产生和降解需要持续进行。溶酶体酸性脂肪酶能为这一过程提供能量。
3.4 lal启动子序列及活性分析
RNA聚合酶能够识别真核生物的核心启动子, 并与其结合后, 可调控基因的转录起始和效率, 保证基因转录的准确性和精确性[31]。通常基因的TATA盒位于转录起始位点的上游–50 bp至–100 bp区域[32], 并且除虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和斑马鱼(Danio rerio)外, 类似TATA的基序(TTTAAA)在所有鱼类中都比较保守[33]。因此识别这些核心启动子是转录起始的一般机制的第一步[34]。在本研究中, lal核心启动子区存在CCAAT和TATA盒, 分别位于–8 bp至–19 bp, –22 bp至–27 bp。黄颡鱼lal的核心启动子区存在下游核心元件(Downstream core element, DCE)、转录起始元件(Initiator, INR), 从而保证基因转录的正常启动[31]。
基因的转录也受转录因子结合位点(Transcription factor binding site, TFBS)的调控作用[35]。根据在线软件预测, 黄颡鱼lal基因的启动子上存在Sp1(–87 bp/–101 bp)、STAT3(–233 bp/–243 bp)和PPARα(–286 bp/–313 bp)结合位点。本研究结果显示5′缺失突变分析结果显示lal的–1016 bp/+51 bp启动子区域正调控启动子活性, 这表明Sp1、STAT3和PPARα可能是lal基因启动子可能存在的正调控转录因子。Sp1属于C2H2型锌指蛋白家族, 它与富含GC的基序结合调节基因的表达[36], Sp1能够协同AP-2正调控lal转录表达[37]。STAT3作为一种转录因子, 正调控CPT Iα1b启动子活性[38]。PPARα是草鱼脂肪组织甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase, ATGL)基因启动子活性的顺式作用元件[39]。而LAL作为一种酸性脂肪酶, 将胆固醇酯(CE)和甘油三酯(TG)水解成游离的胆固醇(FC)和脂肪酸(FFA)[2], 我们可以推测STAT3和PPARα也是lal基因启动子活性的顺式作用元件。
本研究结果显示–1507/–1016区域负调控lal启动子活性。在这个区域中, 存在2个FOXO1结合位点(–1066 bp/–1076 bp、–1333 bp/–1343 bp)。FOXO1在调节代谢、应激反应和细胞凋亡中发挥中心作用, 研究表明FOXO1正调控lal的转录[4]。在本研究中, FOXO1结合位点处于黄颡鱼lal启动子的负调控区域, FOXO1可能是黄颡鱼lal基因潜在的负调控转录因子, 但需要在往后的点突变实验进行论证。另外, 在–2052 bp/–1507 bp区域存在1个PPARγ (–1755 bp/1774 bp)和1个HNF4α(–1758 bp/–1772 bp)位点, 值得注意的是PPARγ结合位点正包含HNF4α结合位点, 这与You等[36]报道PPARα启动子上也存在PPAR位点包含HNF4α结果相似。PPARγ作为脂质代谢过程中的一种重要转录因子, 对脂肪细胞的分化和脂质储存具有重要作用[40], 同样HNF4α是一种核受体转录因子, 在肝脏特异性基因表达中起关键作用[41]。本研究也发现lal在肝脏的表达量比较高, 这提示我们PPARγ和HNF4α能够调节lal的转录表达, 但具体的调节方式有待深入探讨。
4. 结论
本研究克隆得到了lal基因的cDNA全长和5′上游启动子序列, 为深入了解该基因的功能提供了基础。组织表达分析结果表明, lal在心、肝脏、脑、脾脏、肾脏、肌肉、肠系膜脂肪、肠及性腺等组织中都有表达, 这表明lal基因对黄颡鱼体内的代谢调控发挥重要的作用。启动子序列及活性分析, 发现lal核心启动区含TATA和CCAAT盒, 存在多个转录因子, 确定了lal启动子的–1507 bp/–1016 bp区域负调控启动子活性, –1016 bp/+51 bp区域正调控启动子活性, 表明不同的转录因子对lal的转录表达有不同作用。此研究为日后深入了解鱼类lal基因在脂质代谢及相关转录水平调控机制等研究提供科学依据。
-
![]()
图 2 基于NJ法构建的脊椎动物LAL氨基酸序列的系统进化树
节点上数字表示置信度, Bootstrap检验的重复次数为1000次
Figure 2. The neighbor-joining phylogenetic tree based on the amino acid sequences from P. fulvidraco (▲) and other vertebrate species, using MEGA 5.0 with 1000 bootstrap replicates
The numbers on the node indicates the confidence
![]()
图 3 黄颡鱼LAL蛋白三级预测
Figure 3. The three-dimensional structure prediction of LAL protein from P. fulvidraco
![]()
图 4 黄颡鱼lal mRNA的组织表达
心(H)、肝脏(L)、大脑(B)、脾脏(S)、肾脏(K)、肌肉(M)、脂肪(F)、肠(I)、精巢(T)和卵巢(O); 相对mRNA水平通过qPCR定量, 数值(平均值±标准误, n=3)用内参基因(β-actin和ubce)标准化; 不同字母表示有显著性差异(P<0.05)
Figure 4. The relative mRNA levels of P. fulvidraco lal in different tissues
Heart (H), liver (L), brain (B), spleen (S), kidney (K), muscle (M), fat (F), intestine (I), testis (T), ovary (O). The reverse transcription-quantitative PCR (qPCR) data (mean±SE, n=3) were normalized to β-actin and ubce. Different letters indicated significant difference (P<0.05)
![]()
图 5 黄颡鱼5′ lal启动子区启动子活性
**表示极显著差异性, P<0.01
Figure 5. 5′ unidirectional deletion analysis of the lal promoter region for P. fulvidraco
**indicate extremely significant difference, P<0.01
表 1 黄颡鱼lal基因cDNA全长序列的克隆及荧光定量所用的引物
Table 1 Primers used for lal cDNA cloning and PCR
引物Primer 核苷酸序列Sequence (5′—3′) 3′-lal-O AATCAGTCAACCCCTCCAT 3′-lal-I CTGGGAGCACCTGGACTTC 5′-lal-O CAGGCTTAGGCTCTGCTT 5′-lal-I AGGCTCTGCTTCTTGGA lal-F GTTCGAGGTGGTCACTGAGG lal-R CTGGTGTTGGGAAGGTTGGT β-actin-F GCACAGTAAAGGCGTTGTGA β-actin-R ACATCTGCTGGAAGGTGGAC ubce-F TCAAGAAGAGCCAGTGGAGG ubce-R TAGGGGTAGTCGATGGGGAA rpl-7-F GGCAAATGTACAGGAGCGAG rpl-7-R GCCTTGTTGAGCTTGACGAA gapdh-F TTTCAGCGAGAGAGACCCAG gapdh-R ATGACTCTCTTGGCACCTCC 
下载: 导出CSV
表 2 黄颡鱼lal cDNA启动子克隆所用到的引物
Table 2 Primers used for lal promoter cloning of P. fulvidraco
引物Primer 核苷酸序列Sequence (5′—3′) RT-PCR-F CTGAGCACCGAGATCCAC RT-PCR-R TAATAATCCCGCCTTCTC pGL3-554/+51 F ctatcgataggtaccgagctcTCCCCTCGCCTTGTCCCA pGL3-554/+51 R cagtaccggaatgccaagcttTAATAATCCCGCCTTCTCTATTACG pGL3-1016/+51 F ctatcgataggtaccgagctcTTCAAATTACAACCAGCCAAAGC pGL3-1016/+51 R cagtaccggaatgccaagcttTAATAATCCCGCCTTCTCTATTACG pGL3-1567/+51 F ctatcgataggtaccgagctcCACACTTTAATATACATGTACTATACATCACCT pGL3-1567/+51 R cagtaccggaatgccaagcttTAATAATCCCGCCTTCTCTATTACG pGL3-2052/+51 F ctatcgataggtaccgagctcCTTCCCCCTGGAACATGCA pGL3-2052/+51 R cagtaccggaatgccaagcttTAATAATCCCGCCTTCTCTATTACG
下载: 导出CSV
-
[1] Morais S, Bell J G, Robertson D A, et al. Protein/lipid ratios in extruded diets for atlantic cod (Gadus morhua L.): effects on growth, feed utilisation, muscle composition and liver histology [J]. Aquaculture, 2001, 203(1-2): 101-119. doi: 10.1016/S0044-8486(01)00618-4
[2] Gomaraschi M, Bonacina F, Norata G D. Lysosomal acid lipase: from cellular lipid handler to immunometabolic target [J]. Trends in Pharmacological Sciences, 2019, 40(2): 104-115. doi: 10.1016/j.tips.2018.12.006
[3] Zhang H. Lysosomal acid lipase and lipid metabolism: new mechanisms, new questions, and new therapies [J]. Current Opinion Lipidology, 2018, 29(3): 218-223. doi: 10.1097/MOL.0000000000000507
[4] Lettieri Barbato D, Tatulli G, Aquilano K, et al. Foxo1 controls lysosomal acid lipase in adipocytes: implication of lipophagy during nutrient restriction and metformin treatment [J]. Cell Death & Disease, 2013, 4(10): e861.
[5] Ameis D, Merkel M, Eckerskorn C, et al. Purification, characterization and molecular cloning of human hepatic lysosomal acid lipase [J]. European Journal Biochemistry, 1994, 219(3): 905-914. doi: 10.1111/j.1432-1033.1994.tb18572.x
[6] Dwek R A, Edge C J, Harvey D J, et al. Analysis of glycoprotein-associated oligosaccharides [J]. Annual Review of Biochemistry, 1993, 62(1): 65-100. doi: 10.1146/annurev.bi.62.070193.000433x
[7] Pfeffer S R. Mannose 6-phosphate receptors and their role in targeting proteins to lysosomes [J]. The Journal of Membrane Biology, 1988, 103(1): 7-16. doi: 10.1007/BF01871928
[8] Dubland J A, Francis G A. Lysosomal acid lipase: at the crossroads of normal and atherogenic cholesterol metabolism [J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2015(3): 3.
[9] Benevides G N, Miura I K, Person N C, et al. Lysosomal acid lipase deficiency in brazilian children: a case series [J]. Journal de Pediatria, 2019, 95(5): 552-558. doi: 10.1016/j.jped.2018.05.016
[10] Evans T D, Zhang X, Clark R E, et al. Functional characterization of LIPA (lysosomal acid lipase) variants associated with coronary artery disease [J]. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2019, 39(12): 2480-2491. doi: 10.1161/ATVBAHA.119.313443
[11] 农业部渔业局. 中国渔业统计年鉴 [M]. 北京: 中国农业出版社, 2019: 1-138. Fisheries Bureau of the Ministry of Agriculture. China Fishery Statistical Yearbook [M]. Beijing: China Agricultural Press, 2019: 1-138.
[12] Wu K, Zheng J L, Luo Z, et al. Carnitine palmitoyltransferase I gene in Synechogobius hasta: cloning, mRNA expression and transcriptional regulation by insulin in vitro [J]. Gene, 2016, 576(1): 429-440. doi: 10.1016/j.gene.2015.10.055
[13] 卓梅琴. 黄颡鱼PI3Ks功能解析及其通路在胰岛素调控脂类代谢中的作用机制 [D]. 武汉: 华中农业大学, 2018: 1-109. Zhuo M Q. Functional analysis of PI3Ks and its related signal pathway in insulin regulating lipid metabolism in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2018: 1-109.
[14] Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods [J]. Molecular Biology & Evolution, 2011, 28(10): 2731-2739.
[15] Jones D T, Taylor W R, Thornton J M. The rapid generation of mutation data matrices from protein sequences [J]. Computer Applications in the Biosciences, 1992, 8(3): 275-282.
[16] Roussel A, Miled N, Berti-Dupuis L, et al. Crystal structure of the open form of dog gastric lipase in complex with a phosphonate inhibitor [J]. The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(3): 2266-2274. doi: 10.1074/jbc.M109484200
[17] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–∆∆ CT method [J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408. doi: 10.1006/meth.2001.1262
[18] Gong G, Dan C, Xiao S, et al. Chromosomal-level assembly of yellow catfish genome using third-generation DNA sequencing and Hi-C analysis [J]. Gigascience, 2018, 7(11): 1-9.
[19] Zschenker O, Bähr C, Hess U F, et al. Systematic mutagenesis of potential glycosylation sites of lysosomal acid lipase [J]. Journal of Biochemistry, 2005, 137(3): 387-394. doi: 10.1093/jb/mvi043
[20] Vinje T, Laerdahl J K, Bjune K, et al. Characterization of the mechanisms by which missense mutations in the lysosomal acid lipase gene disrupt enzymatic activity [J]. Human Molecular Genetics, 2019, 28(18): 3043-3052. doi: 10.1093/hmg/ddz114
[21] Liu Y, Nguyen A, Wolfert R L, et al. Enhancing the secretion of recombinant proteins by engineering n-glycosylation sites [J]. Biotechnology Progress, 2009, 25(5): 1468-1475. doi: 10.1002/btpr.241
[22] 谭号, 李英文, 饶剑军, 等. 乙炔基雌二醇(EE2)对雄性黄颡鱼GtH3个亚基基因表达的影响 [J]. 水生生物学报, 2015, 39(6): 1117-1125. doi: 10.1146/annurev.bi.62.070193.000433 Tan H, Li Y W, Rao J J, et al. The expression of three gonadotropin subunits in response to 17-ethynylestradiol in male Pelteobagrus fulvidraco [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2015, 39(6): 1117-1125. doi: 10.1146/annurev.bi.62.070193.000433
[23] Ataya F S. Cloning, Phylogenetic analysis and 3D modeling of a putative lysosomal acid lipase from the camel, Camelus dromedaries [J]. Molecules, 2012, 17(9): 10399-10413. doi: 10.3390/molecules170910399
[24] Lohse P, Chahrokh-Zadeh S, Lohse P, et al. Human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase and human gastric lipase: identification of the catalytically active serine, aspartic acid, and histidine residues [J]. Journal of Lipid Research, 1997, 38(5): 892-903. doi: 10.1016/S0022-2275(20)37214-X
[25] Pagani F, Pariyarath R, Stuani C, et al. Cysteine residues in human lysosomal acid lipase are involved in selective cholesteryl esterase activity [J]. Biochemical Journal, 1997, 326(1): 265-269. doi: 10.1042/bj3260265
[26] Rajamohan F, Reyes A R, Tu M, et al. Crystal Structure of human lysosomal acid lipase and its implications in cholesteryl ester storage disease (CESD) [J]. Journal of Lipid Research, 2020, 61(8): 1192-1202. doi: 10.1194/jlr.RA120000748
[27] Holmes R S, Vandeberg J L, Cox L A. Genomics and proteomics of vertebrate cholesterol ester lipase (LIPA) and cholesterol 25-hydroxylase (CH25H) [J]. 3 Biotech, 2011, 1(2): 99-109. doi: 10.1007/s13205-011-0013-9
[28] Kitadokoro K, Tanaka M, Hikima T, et al. Crystal structure of pathogenic staphylococcus aureus lipase complex with the anti-obesity drug orlistat [J]. Scientific Reports, 2020, 10(1): 5469. doi: 10.1038/s41598-020-62427-8
[29] Roussel A, Canaan S, Egloff M P, et al. Crystal structure of human gastric lipase and model of lysosomal acid lipase, two lipolytic enzymes of medical interest [J]. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(24): 16995-17002. doi: 10.1074/jbc.274.24.16995
[30] Du H, Witte D P, Grabowski G A. Tissue and cellular specific expression of murine lysosomal acid lipase mRNA and protein [J]. Journal of Lipid Research, 1996, 37(5): 937-949. doi: 10.1016/S0022-2275(20)42005-X
[31] Lenhard B, Sandelin A, Carninci P. Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation [J]. Nature Reviews Genetics, 2012, 13(4): 233-245.
[32] Valen E, Sandelin A. Genomic and chromatin signals underlying transcription start-site selection [J]. Trends in Genetics, 2011, 27(11): 475-485. doi: 10.1016/j.tig.2011.08.001
[33] De Santis C, Jerry D R. Differential tissue-regulation of myostatin genes in the teleost fish lates calcarifer in response to fasting. Evidence for functional differentiation [J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2011, 335(2): 158-165. doi: 10.1016/j.mce.2011.01.011
[34] Goodrich J A, Tjian R. Unexpected roles for core promoter recognition factors in cell-type-specific transcription and gene regulation [J]. Nature Review Genetics, 2010, 11(8): 549-558. doi: 10.1038/nrg2847
[35] Chan T M, Leung K S, Lee K H. TFBS identification based on genetic algorithm with combined representations and adaptive post-processing [J]. Bioinformatics, 2008, 24(3): 341-349. doi: 10.1093/bioinformatics/btm606
[36] You W J, Fan Y F, Xu Y H, et al. Molecular characterization and functional analysis of PPARα promoter in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco [J]. Gene, 2017(627): 106-113.
[37] Ries S, Büchler C, Langmann T, et al. Transcriptional regulation of lysosomal acid lipase in differentiating monocytes is mediated by transcription factors Sp1 and AP-2 [J]. Journal of Lipid Research, 1998, 39(11): 2125-2134. doi: 10.1016/S0022-2275(20)32467-6
[38] Wu K, Tan X Y, Xu Y H, et al. Functional analysis of promoters of genes in lipid metabolism and their transcriptional response to STAT3 under leptin signals [J]. Genes (
Basel ) , 2018, 9(7): 334. doi: 10.3390/genes9070334 [39] 孙健. 营养限制条件下ATGL维持草鱼脂肪细胞脂质代谢稳态的转录调控机制研究 [D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2019: 1-88. Sun J. Transcriptinal of ATGL and its role in maintaining adipocyte lipid homeostasis in grass carp (Ctenopharyngodon idellus) under nutritional restriction [D]. Yangling: Northwest A and F University, 2019: 1-88.
[40] Chinetti G, Fruchart J C, Staels B. Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs): nuclear receptors at the crossroads between lipid metabolism and inflammation [J]. Inflammation Research, 2000, 49(10): 497-505. doi: 10.1007/s000110050622
[41] Li J, Ning G, Duncan S A. Mammalian hepatocyte differentiation requires the transcription factor HNF-4α [J]. Genes Development, 2000, 14(4): 464-474.
-
期刊类型引用(0)
其他类型引用(2)
计量
- 文章访问数: 1570
- HTML全文浏览量: 693
- PDF下载量: 139
- 被引次数: 2