THE VALIDITY OF SPECIES OF BRACHYMYSTAX TSINLINGENSIS LI BASED ON MITOCHONDRIA CONTROL REGION AND MICROSATELLITE
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摘要: 文章基于线粒体控制区基因序列和微卫星标记比较秦岭细鳞鲑(Brachymystax tsinlingensis Li)、黑龙江流域的尖吻细鳞鲑(Brachymystax lenok Pallas)和钝吻细鳞鲑(Brachymystax tumensis Mori)的分子遗传差异, 为澄清其分类地位争议提供分子证据。结果表明: (1)扩增217个样本的mtDNA D-loop区序列, 共获得45个单倍型, 类群间无共享单倍型; 基于单倍型构建的系统进化树显示三个细鳞鲑类群呈独立的支系; (2)基于14个呈多态性位点的遗传分化结果表明, 秦岭细鳞鲑与尖吻或钝吻细鳞鲑之间的遗传距离均大于尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑之间的遗传距离; (3)基于线粒体D-loop和多态性微卫星位点计算出的遗传分化系数(FST)都远高于0.25, 表明三个类群间的遗传分化程度极高。这些结果表明, 秦岭细鳞鲑与黑龙江流域细鳞鲑之间遗传分化程度高, 结合前期发现秦岭细鳞鲑与黑龙江细鳞鲑类群有明显形态分化的研究结果及它们之间地理隔离已久的现状, 研究初步判定秦岭细鳞鲑为独立物种, 并建议以Brachymystax tsinlingensis Li为拉丁名。同时, 建议将秦岭细鳞鲑作为独立单元进行保护, 避免人为引种或杂交等因素造成种质资源破坏。Abstract: Qinling lenok (Brachymystax tsinlingensis Li), a national Class Ⅱ aquatic protected animal, is in urgent need of germplasm conservation due to the obvious decline of its wild population, however, since its subspecies was named in 1966, the status of its subspecies/species has been controversial until now. The unclear classification status seriously hinders the effective development of conservation work. Based on the mitochondrial control region gene sequence and microsatellite markers, we compared the molecular genetic differences between Qinling lenok and Heilongjiang lenok (Brachymystax lenok Pallas and Brachymystax tumensis Mori), to provide molecular evidence for clarifying the taxonomic status of Qinling lenok. The results showed as follows: (1) A total of 45 haplotypes were obtained by amplified mtDNA D-loop sequences of 217 samples, and no haplotypes were shared among above three groups. Phylogenetic tree based on haplotypes showed that each of the three groups of lenok was an independent clade. (2) The results of genetic differentiation based on 14 polymorphic loci showed that the genetic distance between Qinling lenok and B. lenok, Qinling lenok and B. tumensis was greater than the value between B. lenok and B. tumensis. (3) The genetic differentiation coefficient (FST) based on mitochondrial D-loop and polymorphic microsatellite loci analysis was higher than 0.25, indicating a high degree of genetic differentiation among the three groups. In the present study, a high degree of genetic differentiation among three groups were found. Combined with the previous results of obvious morphological differentiation between Qinling lenok and Heilongjiang lenok, which published by our team and the status of geographical isolation between Qinling and Heilongjiang rivers for a long time, we preliminarily determined that Qinling lenok is an independent species with Latin name Brachymystax tsinlingensis Li. It is suggested that Qinling lenok should be protected as an independent unit to avoid the destruction of germplasm resources caused by artificial introduction or hybridization.
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秦岭细鳞鲑(Brachymystax tsinlingensis Li, 1966)为秦巴山区特有土著鱼类, 隶属于鲑形目Salmoniforms、鲑科Salmonidae, 主要分布于陕西黑河、湑水河、石头河和太白河等山区溪流以及甘肃的渭水支流上游, 为细鳞鲑属鱼类在第四纪冰期自北向南移的残留种[1]。20世纪90年代因野生资源量衰减被列入国家Ⅱ级重点野生保护动物名录[2, 3], 为避免物种灭绝的悲剧在秦岭细鳞鲑上重演, 对其开展种质资源保护和遗传多样性研究十分必要。
然而, 自1964年秦岭细鳞鲑被发现以来[4], 其分类地位一直饱受争议, 有学术观点认为秦岭地区的细鳞鲑是一个新的地方亚种, 有别于分布在新疆和黑龙江地区的细鳞鲑B. lenok lenok (Pallas,1773)[5, 6]; 另一种观点则质疑秦岭细鳞鲑亚种地位, 认为细鳞鲑属在我国不存在亚种分化[7—9], 只有一个物种。近年来, 分布于黑龙江流域的细鳞鲑依吻部形态差异分为钝吻细鳞鲑(B. tumensis Mori, 1930)和尖吻细鳞鲑(B. lenok Pallas, 1773)两个物种[10-13], 并认为秦岭细鳞鲑形态特征更接近于钝吻细鳞鲑[10], 但也有学者认为秦岭细鳞鲑的某些形态特征与尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑都不符合[14], 将秦岭细鳞鲑作为一个独立物种的观点[14—16]。秦岭细鳞鲑的分类地位不明晰, 为种质资源保护工作、相关科学研究开展及保护政策制定都带来极大不便, 例如学者们在撰写秦岭细鳞鲑有关的研究论文时, 犹豫采用亚种名还是物种名来表述其拉丁学名; 细鳞鲑跨地域引种放流因科学依据不明而存在潜在风险。经分析发现, 上述文献主要采用形态学性状、生化同工酶等研究手段讨论秦岭细鳞鲑分类地位, 或仅报道黑龙江流域的钝吻细鳞鲑和尖吻细鳞鲑的分类地位与遗传多样性, 缺乏采用分子手段比较秦岭细鳞鲑与黑龙江流域细鳞鲑遗传差异从而探讨秦岭细鳞鲑分类地位的报道, 而仅有的两篇文章其研究结论又各执一词[15, 16]。
有效进行物种界定是分类学的首要任务, 也是研究系统发育、适应性进化、生物地理学和保护生物学的第一步。明确秦岭细鳞鲑的分类地位和野生种群的遗传变异是有效保护和种质资源合理开发利用的前提。本研究以澄清秦岭细鳞鲑分类地位的历史争议为出发点, 采集陕西秦岭地区和黑龙江流域的细鳞鲑野生种群样本为试验材料, 结合线粒体控制区序列变异和微卫星分子标记比较秦岭细鳞鲑和黑龙江流域细鳞鲑的遗传差异, 以期为濒危鱼类秦岭细鳞鲑种质资源保护提供其分类地位的支撑数据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
野生细鳞鲑样本于2014—2017年采自秦岭地区陕西周至县至太白县的黑河和湑水河, 黑龙江流域的呼玛河和乌苏里江, 依据样本的地理分布位置和吻部形态、体色及斑点等形态性状[10, 14, 17]鉴定划分为尖吻细鳞鲑、钝吻细鳞鲑和秦岭细鳞鲑三个类群。采集样本背鳍下方肌肉, 保存于95%酒精中, 用于提取基因组DNA。样本数量及采集信息见表 1。
表 1 三个细鳞鲑类群样本的基本信息Table 1. Samples information of three Brachymystax groups类群
Group采集地点
Location经度
Longitude纬度
Latitude样本数量
Sample size
for D-loop样本数量
Sample size for
microsatellite采样时间
Sample time尖吻细鳞鲑
B. lenok呼玛河Huma River 126° 29′E 51° 42′N 32 32 2014.7 乌苏里江抓吉段
Zhuaji in Wusuli River134° 39′E 48°13′N 8 8 2014.7 钝吻细鳞鲑
B. tumensis乌苏里江抓吉段
Zhuaji in Wusuli River134° 39′E 48° 13′N 18 18 2014.7 乌苏里江海青段
Haiqing in Wusuli River134° 39′E 47° 52′N 53 53 2017.6 秦岭细鳞鲑
B. tsinlingensis陕西黑河Heihe in Shaanxi
陕西湑水河
Xushui River in Shaanxi107° 49′E 33° 50′N 98 73 2014.10 107° 27′E 33° 44′N 8 8 2017.7 1.2 基因组DNA提取及线粒体D-loop区的扩增
采用苯酚-氯仿法从肌肉中提取基因组DNA。1%琼脂糖凝胶电泳和超微量核酸分析仪检测DNA的质量和浓度。利用鲑科鱼类mtDNA D-loop区通用引物[18]以扩增样本的D-loop序列(F5′-AGAGCGCCGGTGTTGTAATC-3′; R5′-GCTAGCGGGACTTTCTAGGGTC-3′)。PCR扩增反应体系(50 µL), 其中Taq MasterMix 25 µL, 模板DNA 1 μL, 引物各1 μL, 加ddH2O至50 μL。PCR扩增程序为: 94℃预变性4min; 94℃变性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s, 38 个循环; 72℃延伸8min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 对目标条带清晰单一的PCR产物进行纯化回收后送南京金斯瑞生物科技有限公司进行双向测序。
1.3 测序结果比对及遗传分化分析
原始序列经拼接和手工校正后, 用Clustalx v.1.83[19]进行多重序列比对。利用MEGA6 [20]分析碱基组成, 转/颠换比, 并计算简约信息位点数及变异位点数。用DnaSP v.5.10[21]计算单倍型数、多态位点数、单倍型多样性、核苷酸多样性指数、单倍型间平均核苷酸差异数和核苷酸多样性等指标; 并对基因分化系数(Gst)及类群间基因流(Nm)进行计算。
以川陕哲罗鲑Hucho bleekeri (GenBank No. HM804473)和多瑙哲罗鲑H. hucho (GenBank No. KM588351)为外群, 利用MEGA6[20]提供的ML最大似然法构建系统进化树, 并进行1000次Bootstrap置信检验。
基于MEGA6的Kimura’s 2-paramenter模型计算类群间两两遗传距离, 并通过Arlequin v. 3.5[22]计算三个细鳞鲑类群的遗传分化系数(FST)和分子方差分析(AMOVA), 进行1000次重排后的显著性检验。
1.4 微卫星位点筛选与引物荧光标记、PCR扩增及微卫星分型
本研究对86个微卫星位点进行了筛选, 随机选取20尾样本的基因组DNA为模板, 用于筛选多态性微卫星位点。PCR扩增反应体系为(12.5 µL): Reaction Mix 6.2 µL, DNA Polymerase (2.5 U/µL) 0.3 µL, 上下游引物各0.5 µL, 模板DNA0.5 µL, 加ddH2O补至12.5 µL。PCR程序为: 94℃预变性4min, 94℃变性30s、退火温度30s、72℃延伸45s, 重复38次循环, 最后72℃延伸8min。
据扩增片段大小及特异性最终筛出14个多态性微卫星位点, 采用荧光标记微卫星技术检测多态性(表 2)。荧光标记引物的PCR反应体系和扩增条件同上, 产物委托西安擎科泽西生物科技有限公司进行毛细管电泳(ABI 3730XL测序仪), 以内标Liz-500(ABI)为参照, 使用GeneMapper 4.1软件计算每个微卫星位点等位基因扩增片段的观测值, 并对微卫星数据进行初步分型。
表 2 14个多态性微卫星位点荧光修饰引物Table 2. Fourteen microsatellite loci and sequences of fluorescent tagged primers分组
Group位点
Locus重复序列
Repeat motif荧光标记
Fluorescent label引物序列
Sequence of
primers (5′—3′)退火温度
Annealing
temperature (℃)产物大小范围
Allele size
range (bp)1 BleTet5 (TGTC)5 FAM CTTCTTCACCCGCCTGAGTGT
TTGAATGGGCTATCTGGCTGT57 160—200 BleTet6 (CTGC)7 TAMRA AGACATCCGCTGCGAAAT
CAGGCATACAGTCAGACATACA53 214—242 BleDi36 (CA)14 HEX GCATATTATGGTCAGTGGGAGT
GTCCTGCTTACACATCAGACAA56 170—212 BleTri19 (TAA)9 FAM CGTTTGGTCTCTCTGCTCTTAT
TATATCGGTTCGCCCTTACTTA56 264—312 2 BLT5 (TG)18 FAM TCTTGAATGCCTACTACTAACC
GCTTTCATCTCATGCAACTG53 76—112 BLT30 (TG)14 TAMRA CTGCACACTCACACCTTCAT
CCTAACCGATGGCTGTCAC58 243—271 BleDi39 (CA)8CG(CA)13 FAM ATCACCTTCAAGCTCTCGTAAA
ATCATAAAAATTGCATCGCTCT56 388—433 BleDi58 (TG)11 HEX CAGGTGATGGTTAGTGATTGTG
CTGACTGGTTAGGGTCAAGAAG56 375—430 3 TL10 (GT)6ATGA(GT)5
ATGA(GT)7GCGG(GA)15FAM AGCCTACCTCTTCTGTCTAGTGAGG
TGTGCAAATAGTTCAAGAACAAAAG63 180—284 BLT14 (TG)11 TAMRA CTACCAGGCGTCAGTGTT
GCAGGAGTATTGGCTATCAG57 194—227 BLT29 (CA)15 HEX TGATACATATGAGGCAAGCA
GTCAGGTACCAGTCATAGTAT58 179—201 4 BleTri08 (GAT)10 FAM ACCTTGAGGGGAAGTAGAATGT
CTTAGGGCTCAGTGTCATCTTC56 345—375 BLT28 (TG)5C(GT)18 FAM CACCCTACCAAGCACCAATAC
TGTCAGGTTGCTTATTCAGAGT58 155—186 TL12 (AC)9...(GT)6TT(TG)5 HEX CTGCAGACTGGATCTTATCAGGAGC
GCATACAAGTACGCACGCCGA63 201—291 1.5 微卫星分型及数据分析
据各微卫星位点初步分型结果, 利用Popgene v.1.32[23]计算群体的遗传参数, 包括观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)。用Arlequin v.3.5[22]进行哈迪-温伯格平衡检验, 并计算固定系数(FIS); 再由CERVUS v.3.0.7[24]计算多态信息含量 (PIC)。使用GENETIX v.4.05.2[25]提供的三维因子对应分析(AFC 3D sur populations)分析三个细鳞鲑类群间的遗传关系与分化程度。
2. 结果
2.1 线粒体DNAD-loop区的分析结果
D-loop区序列差异及遗传多样性分析 本试验共得到1008—1257 bp的有效片段长度, 经序列比对后除去缺失和错配的位点共得到保守位点(Conserved sites) 939个, 简约信息位点54个, 单变异位点12个。在 217个测序个体中, 共检测到45个单倍型(Haplotype, Hap), 已上传GenBank (MH885368-MH885412)其中秦岭细鳞鲑类群14个单倍型(分别为Hap1-14), 尖吻细鳞鲑类群8个(分别为Hap15-22), 钝吻细鳞鲑类群23个(分别为Hap23-45; 表 3), 三个类群间不存在共享单倍型。单倍型多样性指数(Haplotype diversity, Hd)为0.9405, 平均核苷酸差异数(Average number of nucleotide differences, k)为15.3743。
表 3 基于线粒体D-loop的三个细鳞鲑类群遗传多样性分析Table 3. Analysis of genetic diversity for the three Brachymystax groups based on mtDNA D-loop sequences类群
Group序列全长
Sequence (bp)单倍型数
Haplotypes单倍型多样性指数
Haplotype
diversity多态位点数
Polymorphic loci平均核苷酸差异数
Average number of
nucleotide
differences (k)核苷酸多样性指数
Nucleotide
diversity (Pi)秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis1008—1170 14 0.8221 24 5.290 0.00525 尖吻细鳞鲑
B. lenok1089—1253 8 0.7077 24 2.037 0.00187 钝吻细鳞鲑
B. tumensis1092—1257 23 0.9292 17 4.259 0.00390 基于单倍型数据计算各细鳞鲑类群遗传多样性, 结果表明钝吻细鳞鲑类群Hd最高, 秦岭细鳞鲑类群居中, 尖吻细鳞鲑类群最低, 分别为0.9292, 0.8221和0.7077; 平均核苷酸差异数(k)和核苷酸多样性指数(Pi)是秦岭细鳞鲑类群的最高, 分别为5.290和0.00525, 尖吻细鳞鲑类群的平均核苷酸差异数(k)和核苷酸多样性指数(Pi)最低, 分别为2.037和0.00187(表 3)。
三个细鳞鲑类群两两之间的遗传分化参数见表 4。秦岭细鳞鲑类群与黑龙江流域内的两个类群(尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑)之间均表现出较高的地理遗传分化差异(GammaSt=0.57207和GammaSt=0.53694), 而尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑之间的地理遗传分化差异略低(GammaSt=0.48123), 表明秦岭细鳞鲑与尖吻细鳞鲑、钝吻细鳞鲑类群都存在较高的地理遗传分化, 为具有显著的遗传分化的类群。三个类群两两之间的基因流Nm值在0.1659—0.8850, 数值小于 1说明类群之间可能不存在基因交流。
表 4 基于线粒体D-loop的三个细鳞鲑类群间遗传分化参数Table 4. Analysis of genetic differentiation among three Brachymystax groups based on mtDNA D-loop sequences类群1
Group 1类群2
Group 2基因多样度
Hs平均核苷酸差异数
Kxy基因分化系数
Gst地理单元间遗传分化系数
GammaSt基因流
Nm秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis尖吻细鳞鲑
B. lenok0.79149 23.88892 0.10717 0.57207 0.1659 秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis钝吻细鳞鲑
B. tumensis0.86481 21.78289 0.06481 0.53694 0.2554 尖吻细鳞鲑
B. lenok钝吻细鳞鲑
B. tumensis0.85052 14.09930 0.09034 0.48123 0.8850 D-loop区单倍型构建系统进化树 基于45个单倍型(D-loop区)构建的最大似然树(ML)显示三个细鳞鲑类群被分为两个较大支系, 即钝吻细鳞鲑类群单独成一个支系, 而秦岭细鳞鲑和尖吻细鳞鲑成一个大的支系, 但秦岭细鳞鲑类群和尖吻细鳞鲑类群的单倍型各自聚为两个独立的支系, 基本能从进化树上区分这三个类群(图 1)。
图 1 基于线粒体D-loop区构建的三个细鳞鲑类群的系统进化树 (ML), 树上标记支持率>90%的主要进化枝○为外群; ▲为钝吻细鳞鲑(Hap23—45); △为尖吻细鳞鲑(Hap15—22); ●为秦岭细鳞鲑(Hap1—14)Figure 1. Phylogenetic tree for three Brachymystax groups base on mtDNA D-loop sequences (ML), bootstrap values is displayed among main clades when Bootstrap values >90%Different symbols represent different groups; ○ represents outgroup; ▲ represents B. tumensis (Hap23-45); △ represents B. lenok (Hap15-22); ● represents B. lenok tsinlingensis (Hap1-14)由单倍型最小网络图(图 2)可知: 不同细鳞鲑类群之间也不存在共享单倍型, 类群间单倍型的突变过程中存在较多缺失的单倍型(mv), 尖吻细鳞鲑类群的单倍型Hap-20(简写: H-20)与钝吻细鳞鲑类群的单倍型H-30之间仅通过一步突变, 由此推测尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑这两个类群在进化历史上有过基因交流。值得一提的是尖吻细鳞鲑类群的两个单倍型(H-15和H-16)与H-22, 以及本类群其他单倍型之间有一定程度的遗传分化(图 2), 这种分化可能与尖吻细鳞鲑样本采自不同河流有关, 如H-15和H-16的样本采自于乌苏里江抚远县抓吉镇的两个个体, 而H22单倍型的两个个体则采自呼玛河, 这两个采集地地理距离较远。H-15和H-16与本类群的其他单倍型大部分序列一致, 由于存在一个短片段(97 bp)与尖吻类群其他单倍型差异较大, 其中有 23 个 SNP 位点与秦岭类群一致, 有 19 个 SNP 位点与钝吻类群一致, 因而在单倍型网络图中这两个单倍型被归到秦岭类群与钝吻类群之间, 推测这两个单倍型可能代表更古老的尖吻细鳞鲑单倍型。
图 2 三个细鳞鲑类群的单倍型网络图红色节点(mv)表示缺失单倍型; 钝吻细鳞鲑(Hap23—45); 尖吻细鳞鲑(Hap15—22); 秦岭细鳞鲑(Hap1—14); 圆圈面积与单倍型频率成正比Figure 2. Median-joining networks for three Brachymystax groupsred nodes (mv) indicate missing haplotype, B. tumensis (Hap23—45); B. lenok (Hap15—22); B. lenok tsinlingensis (Hap1—14); the sizes of circles are proportional to haplotype frequency三个细鳞鲑类群的遗传结构 类群间遗传距离与遗传分化系数分析结果显示: 秦岭细鳞鲑与尖吻细鳞鲑之间的遗传距离和遗传分化系数分别为0.0375和0.75081; 秦岭细鳞鲑与钝吻细鳞鲑之间分别为0.0374和0.66188; 尖吻细鳞鲑与钝吻细鳞鲑之间分别为0.0273和0.36102; 表明三个细鳞鲑类群间存在较大分化, 且秦岭细鳞鲑与尖吻细鳞鲑、钝吻细鳞鲑之间的遗传距离大于尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑之间的遗传距离(表 5)。
表 5 基于线粒体D-loop序列和微卫星标记分析三个细鳞鲑类群的遗传分化系数FST(左下)与遗传距离(右上)Table 5. Pairwise FST values (left bottom) and genetic distance (upper right) among three Brachymystax groups based on mtDNA D-loop and microsatellite loci分子标记
Molecular marker类群
Group秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis尖吻细鳞鲑
B. lenok钝吻细鳞鲑
B. tumensisD-loop区
mtDNA D-loop秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis0.0375 0.0374 尖吻细鳞鲑
B. lenok0.75081* 0.0273 钝吻细鳞鲑
B. tumensis0.66188* 0.36102* 微卫星标记
Microsatellite loci秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis3.6978 3.8246 尖吻细鳞鲑
B. lenok0.6143** 1.4075 钝吻细鳞鲑
B. tumensis0.5992** 0.4606** 注: *P<0.001 代表差异极显著; **Bonferroni校正后仍显著Note: *P<0.001 means significant pairwise differences; ** represents significant differences after Bonferroni correction 分子方差变异分析(AMOVA)结果显示类群间分子变异占66.57%, 而类群内样本间的变异仅33.43%, 三个类群间的固定系数(FST)值为0.66565(P<0.001; 表 6)。
表 6 基于线粒体D-Loop序列和微卫星标记的3个细鳞鲑类群的分子方差分析Table 6. Molecular variance (AMOVA) analysis for three Brachymystax groups based on mtDNA D-loop and microsatellite loci分子标记
Molecular marker变异来源
Source of variation自由度
df平方和
Sum of squares方差组分
Variance
components变异百分率
Percentage of
variation (%)固定系数FST
Fixation indexP-value D-loop区
mtDNA D-loop类群间Among groups 2 5798.867 42.75754 66.57 0.66565 0.0000* 类群内Within groups 214 4595.953 21.47642 33.43 总计 Total 216 10394.820 64.23396 微卫星标记
Microsatellite loci类群间Among groups 2 946.142 3.80785 57.13 FIS=0.32745
FST=0.57128
FIT=0.711670.00000*
0.00000*
0.00000*类群内样本间
Among individuals
within groups189 716.939 0.93573 14.04 样本内 Within individuals 192 369.00 1.92188 28.83 总计 Total 383 2032.081 6.66545 注: *P<0.001 代表差异极显著Note: *P<0.001 means significant pairwise differences 2.2 微卫星标记的分析结果
基于微卫星标记的遗传多样性分析 本试验从14个多态性微卫星位点中获得225个等位基因, 三个类群的平均等位基因数目(Na)在3.0714(秦岭细鳞鲑)—7.1429(尖吻细鳞鲑)。由表 7可知, 三个类群中, 所有多态性微卫星位点都表现为观测杂合度(Ho)比期望杂合度(He)低的现象, 这提示在细鳞鲑类群中存在杂合子缺失的可能。香农信息指数(I)的大小体现了类群内生物多样性的高低, 秦岭细鳞鲑类群的I值(0.6055)偏低, 而尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑类群的I值较高, 分别是1.0806和1.0153。秦岭细鳞鲑、尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑的平均近交系数(FIS)分别为0.36823、0.42322和0.24285, 多态信息含量(PIC)分别为0.2919, 0.4399和0.4334。
表 7 基于 14 个多态性微卫星位点的3个细鳞鲑类群的遗传多样性分析结果Table 7. Results of genetic diversity analysis based on fourteen polymorphism microsatellite loci in three Brachymystax groups多态性位点
Polymorphic locus参数
Paramen-ters类群Group 秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis
(N=81)尖吻细鳞鲑
B. lenok
(N=40)钝吻细鳞鲑
B. tumensis
(N=71)14 Na 3.0714 7.1429 5.8571 Ne 1.9389 3.0806 3.3276 I 0.6055 1.0806 1.0153 Ho 0.2055 0.2679 0.3571 He 0.3245 0.4619 0.4709 PIC 0.2919 0.4399 0.4334 FIS 0.36823 0.42322 0.24285 注: 等位基因数(Na); 有效等位基因数(Ne); 香农信息指数(I); 观测杂合度(Ho); 期望杂合度(He); 多态信息含量(PIC); 平均近交系数(FIS)Note: Na. Observed number of alleles; Ne. Effective number of alleles; I. Shannon’s Information index; Ho. observed heterozygosity; He. Expected heterozygosity; PIC. polymorphism information content; FIS. Fixation indices 三个细鳞鲑类群的遗传结构分析 分子方差分析(AMOVA)结果显示类群间的分子差异占57.13%, 类群内的分子差异占14.04%, 还有28.83%的差异是由样本本身不同位点间的分子差异造成的(表 6); 由表 5可知, 秦岭细鳞鲑类群和尖吻细鳞鲑类群之间的FST和遗传距离分别为0.6143和3.6978, 秦岭细鳞鲑类群和钝吻细鳞鲑类群之间的FST和遗传距离分别为0.5992和3.8246, FST和遗传距离最小值出现在尖吻细鳞鲑类群和钝吻细鳞鲑类群之间, 分别是 0.4606和1.4075, 该结果与mtDNA D-loop区分析结果的趋势一致。
基于14个多态性微卫星位点的所有等位基因型, 对三个细鳞鲑类群通过三维坐标对三个类群的遗传分化关系进行解释。由图 3可知, 坐标轴1(Axe 1)和2(Axe 2)能够完全区分三个类群, 两者分别解释三个类群间总遗传变异的57.79%和42.21%。在Axe 1水平上, 秦岭细鳞鲑类群中的所有样本首先聚在一起, 与黑龙江流域内的尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑明显分隔。其次, 在Axe 2水平上, 尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑又被划分为两个互不重叠的类群。值得注意的是, 基于微卫星位点的三维坐标图也出现了和单倍型网络图类似的结果, 即尖吻细鳞鲑类群内部有一定程度的遗传分化。
3. 讨论
3.1 三个细鳞鲑类群的遗传多样性
本试验的三个细鳞鲑类群间无共享单倍型, 其中秦岭细鳞鲑类群的单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样度(Pi)分别是0.8221和0.00525; 尖吻细鳞鲑分别是0.7077和0.00187; 钝吻细鳞鲑则为0.9292和0.00390。Grant和Bowen[26]认为当Hd>0.5且Pi>0.005时, 预示着该群体拥有较高的遗传多样性; 当群体Pi<0.005时, 则表现为低核苷酸多样度, 因而秦岭细鳞鲑类群表现出较高的遗传多样性, 可能与本研究中秦岭细鳞鲑采样点横跨秦岭南北两侧的山涧溪流有关, Shao等[27]利用线粒体DNA Cyt b基因评估秦岭南北坡(即黄河水系和汉江水系)细鳞鲑的分化时间约0.2MY。
基于微卫星位点分析的多态信息含量(PIC)指标的数值, 可间接性地反映遗传多样性的高低。一般认为PIC可分3个等级: 若 PIC<0.25, 则表明群体呈低度多态性; 若 PIC在0.25—0.5, 则表明群体的多态性呈中度多态; 若PIC>0.5, 则表明群体呈高度多态性[28]。本文中秦岭细鳞鲑类群的PIC为0.2919, 尖吻和钝吻细鳞鲑类群的PIC分别为0.4399和0.4334, 这3个类群的PIC数值都在0.25—0.5, 因而秦岭细鳞鲑、尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑类群的遗传多样性均处于中度多态水平。从濒危物种资源保护的角度来说, 其多样性存在进一步降低的潜在风险(尤其是秦岭细鳞鲑), 可通过增加保护力度防止生境破碎化、选择遗传差异较大的野生亲鱼作为人工放流群体的亲本来源等方式避免遗传多样性进一步降低。
3.2 细鳞鲑类群间遗传分化及秦岭细鳞鲑物种有效性
遗传分化系数(FST)和类群间遗传距离可反映群体间的遗传分化程度。据报道, 当FST<0.05时, 群体间遗传分化程度很低; 当FST在0.05—0.15, 则群体间的遗传分化程度接近中等水平; 当FST在0.15—0.25, 说明群体间的遗传分化程度比较高; 当FST值超过0.25时, 群体间的遗传分化程度极高[29]。本试验基于线粒体D-loop和多态性微卫星位点分析得到的FST都远高于0.25, 表明3个类群间有极高的遗传分化。分子遗传距离也可作为判定物种分化的重要参考数据, 如Serrano 等[30]利用mtDNA分析采自美国、巴西等地121尾溪脂鲤属(Characidium)鱼类样本, 发现除C. zebra外种间遗传距离均高于0.02, 并结合系统发育分析、单倍型网络分析和形态学分析将三个C. zebra地理群体归为一个物种, 并将C. alipioi划分为两个物种。本研究中基于线粒体控制区计算的遗传距离中, 尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑之间的值最小(0.0273), 而秦岭细鳞鲑与前二者的遗传距离(分别为0.0375和0.0374)均大于前二者之间的遗传距离。马波和姜作发[12]基于10个多态性微卫星位点计算出尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑的遗传距离为0.9393, 判定两者的遗传分化程度已达种水平, 而本试验中秦岭类群与尖吻类群(3.6978), 与钝吻类群的遗传距离(3.8246)远大于尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑之间的平均遗传距离(1.4075)。此外, 三个细鳞鲑类群的基因流计算结果均小于1, 证明三个类群之间的基因流也受到阻碍[31]。以上证据表明秦岭细鳞鲑与另外两者的分化可能已达种水平。
先前的一些研究也曾探讨细鳞鲑不同群体的遗传分化, 例如夏颖哲等[32]通过比对835 bp 的D-loop部分序列差异, 发现黑龙江、长白山地区和古黄河地区的细鳞鲑存在高度遗传分化, 无共享单倍型; 杜岩岩等[15]野外采集25尾甘肃秦岭细鳞鲑样品, 以598 bp mtDNA控制区序列分析得到3个单倍型, 与GenBank黑龙江的尖吻细鳞鲑与钝吻细鳞鲑数据进行比对, 系统进化树显示秦岭细鳞鲑单独成一支, 支持秦岭细鳞鲑亚种分类地位。Xing等[16]除对细鳞鲑属不同种类的形态差异进行详细描述外, 还比对GenBank 中细鳞鲑Cyt b基因数据, 发现秦岭细鳞鲑类群在系统发育树上呈一个单系群, 与尖吻细鳞鲑构成一个分支, 从而认为秦岭细鳞鲑为一个有效的独立物种。以上文献均未发现共享单倍型, 但系统发育树略微不同, 结论也不尽相同。造成这种现象的可能原因是mtDNA不同基因或同一基因不同片段的变异程度不同, 或仅用某一短片段进行小样本遗传多样性分析时往往存在偏差。本研究中线粒体D-loop区段长度大于1000 bp, 并结合核基因的微卫星分子标记分析超过200尾样本的分子差异, 所反映的信息更加全面。
能否正确识别和定义物种对于生物多样性保护尤为重要, 如果不能正确划分物种, 就很有可能发生偏差: 应受到保护的物种没有得到合理保护, 不该被保护的却得以保护。目前广泛认可的生物学物种界限是“生殖隔离”, 然而实际操作中很难实施, 很多鱼类世代周期长达几年甚至十几年, 实验室养殖及传代过程死亡率高, “杂种不育”的检验标准因费时费力、代价高昂也被鱼类分类学家摒弃; 随着分子生物学技术的迅速发展, 进化物种概念逐渐被广泛接受。
进化物种概念将物种界定的重心转移到物种进化过程中的谱系识别和分化程度上。Miralles等 [33]对一个未经证实的候选物种(Unconfirmed candidate species)提出以下几个方面的界定标准: (1)形态学: 至少有一个固定的可诊断的差异特征(可数性状或可量性状)[34]; (2)mtDNA或 nDNA: 所选基因或序列构建分子进化树, 各分支上的Bootstrap置信检验支持率在95%以上[35]; (3)单倍型(mtDNA 或 nDNA): 目的类群与所讨论的其他进化分支间无共享单倍型[36]。若是形态学和分子生物学分析结果满足以上3个条件中任意1项, 则将候选物种判为亚种; 若满足以上3个条件中任意2项或全部符合, 则将候选物种判为物种。
参照以上物种分类界定标准, 结合本团队前期发表的形态学差异结果[17, 37], 秦岭细鳞鲑分类地位的研究结果契合以下候选物种的界定标准: (1) 三个细鳞鲑类群在32项比例性状和5项可数性状(如鳃耙数、侧线鳞数、幽门盲囊数等)上存在极显著差异(P<0.01); (2) 基于mtDNA D-loop区单倍型构建的系统发育树显示三个类群各自聚为一支, 且每个分支的Bootstrap检验支持率90%以上; (3) 在mtDNA D-loop区序列的遗传分析中, 秦岭细鳞鲑在某些微卫星位点上存在特有等位基因型且与另外两个类群无共享单倍型, 它与尖吻细鳞鲑和钝吻细鳞鲑分布的黑龙江流域长期地理隔离造成基因流中断, 而由地理隔离、生态位分化或生物学差异造成的基因流停止是成种的必要条件[38], 因而本文基于秦岭与黑龙江流域地理隔离已久的事实和以上形态与分子差异的分析结果, 初步认为候选物种秦岭细鳞鲑为独立物种, 并建议今后以Brachymystax tsinlingensis Li, 1966为其拉丁学名。同时, 本研究建议将秦岭细鳞鲑作为独立单元进行种质资源保护, 避免人为引种或杂交等因素造成与尖吻细鳞鲑或钝吻细鳞鲑之间的基因交流, 从而导致其生物多样性遭到破坏。
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图 1 基于线粒体D-loop区构建的三个细鳞鲑类群的系统进化树 (ML), 树上标记支持率>90%的主要进化枝
○为外群; ▲为钝吻细鳞鲑(Hap23—45); △为尖吻细鳞鲑(Hap15—22); ●为秦岭细鳞鲑(Hap1—14)
Figure 1. Phylogenetic tree for three Brachymystax groups base on mtDNA D-loop sequences (ML), bootstrap values is displayed among main clades when Bootstrap values >90%
Different symbols represent different groups; ○ represents outgroup; ▲ represents B. tumensis (Hap23-45); △ represents B. lenok (Hap15-22); ● represents B. lenok tsinlingensis (Hap1-14)
图 2 三个细鳞鲑类群的单倍型网络图
红色节点(mv)表示缺失单倍型; 钝吻细鳞鲑(Hap23—45); 尖吻细鳞鲑(Hap15—22); 秦岭细鳞鲑(Hap1—14); 圆圈面积与单倍型频率成正比
Figure 2. Median-joining networks for three Brachymystax groups
red nodes (mv) indicate missing haplotype, B. tumensis (Hap23—45); B. lenok (Hap15—22); B. lenok tsinlingensis (Hap1—14); the sizes of circles are proportional to haplotype frequency
表 1 三个细鳞鲑类群样本的基本信息
Table 1 Samples information of three Brachymystax groups
类群
Group采集地点
Location经度
Longitude纬度
Latitude样本数量
Sample size
for D-loop样本数量
Sample size for
microsatellite采样时间
Sample time尖吻细鳞鲑
B. lenok呼玛河Huma River 126° 29′E 51° 42′N 32 32 2014.7 乌苏里江抓吉段
Zhuaji in Wusuli River134° 39′E 48°13′N 8 8 2014.7 钝吻细鳞鲑
B. tumensis乌苏里江抓吉段
Zhuaji in Wusuli River134° 39′E 48° 13′N 18 18 2014.7 乌苏里江海青段
Haiqing in Wusuli River134° 39′E 47° 52′N 53 53 2017.6 秦岭细鳞鲑
B. tsinlingensis陕西黑河Heihe in Shaanxi
陕西湑水河
Xushui River in Shaanxi107° 49′E 33° 50′N 98 73 2014.10 107° 27′E 33° 44′N 8 8 2017.7 表 2 14个多态性微卫星位点荧光修饰引物
Table 2 Fourteen microsatellite loci and sequences of fluorescent tagged primers
分组
Group位点
Locus重复序列
Repeat motif荧光标记
Fluorescent label引物序列
Sequence of
primers (5′—3′)退火温度
Annealing
temperature (℃)产物大小范围
Allele size
range (bp)1 BleTet5 (TGTC)5 FAM CTTCTTCACCCGCCTGAGTGT
TTGAATGGGCTATCTGGCTGT57 160—200 BleTet6 (CTGC)7 TAMRA AGACATCCGCTGCGAAAT
CAGGCATACAGTCAGACATACA53 214—242 BleDi36 (CA)14 HEX GCATATTATGGTCAGTGGGAGT
GTCCTGCTTACACATCAGACAA56 170—212 BleTri19 (TAA)9 FAM CGTTTGGTCTCTCTGCTCTTAT
TATATCGGTTCGCCCTTACTTA56 264—312 2 BLT5 (TG)18 FAM TCTTGAATGCCTACTACTAACC
GCTTTCATCTCATGCAACTG53 76—112 BLT30 (TG)14 TAMRA CTGCACACTCACACCTTCAT
CCTAACCGATGGCTGTCAC58 243—271 BleDi39 (CA)8CG(CA)13 FAM ATCACCTTCAAGCTCTCGTAAA
ATCATAAAAATTGCATCGCTCT56 388—433 BleDi58 (TG)11 HEX CAGGTGATGGTTAGTGATTGTG
CTGACTGGTTAGGGTCAAGAAG56 375—430 3 TL10 (GT)6ATGA(GT)5
ATGA(GT)7GCGG(GA)15FAM AGCCTACCTCTTCTGTCTAGTGAGG
TGTGCAAATAGTTCAAGAACAAAAG63 180—284 BLT14 (TG)11 TAMRA CTACCAGGCGTCAGTGTT
GCAGGAGTATTGGCTATCAG57 194—227 BLT29 (CA)15 HEX TGATACATATGAGGCAAGCA
GTCAGGTACCAGTCATAGTAT58 179—201 4 BleTri08 (GAT)10 FAM ACCTTGAGGGGAAGTAGAATGT
CTTAGGGCTCAGTGTCATCTTC56 345—375 BLT28 (TG)5C(GT)18 FAM CACCCTACCAAGCACCAATAC
TGTCAGGTTGCTTATTCAGAGT58 155—186 TL12 (AC)9...(GT)6TT(TG)5 HEX CTGCAGACTGGATCTTATCAGGAGC
GCATACAAGTACGCACGCCGA63 201—291 表 3 基于线粒体D-loop的三个细鳞鲑类群遗传多样性分析
Table 3 Analysis of genetic diversity for the three Brachymystax groups based on mtDNA D-loop sequences
类群
Group序列全长
Sequence (bp)单倍型数
Haplotypes单倍型多样性指数
Haplotype
diversity多态位点数
Polymorphic loci平均核苷酸差异数
Average number of
nucleotide
differences (k)核苷酸多样性指数
Nucleotide
diversity (Pi)秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis1008—1170 14 0.8221 24 5.290 0.00525 尖吻细鳞鲑
B. lenok1089—1253 8 0.7077 24 2.037 0.00187 钝吻细鳞鲑
B. tumensis1092—1257 23 0.9292 17 4.259 0.00390 表 4 基于线粒体D-loop的三个细鳞鲑类群间遗传分化参数
Table 4 Analysis of genetic differentiation among three Brachymystax groups based on mtDNA D-loop sequences
类群1
Group 1类群2
Group 2基因多样度
Hs平均核苷酸差异数
Kxy基因分化系数
Gst地理单元间遗传分化系数
GammaSt基因流
Nm秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis尖吻细鳞鲑
B. lenok0.79149 23.88892 0.10717 0.57207 0.1659 秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis钝吻细鳞鲑
B. tumensis0.86481 21.78289 0.06481 0.53694 0.2554 尖吻细鳞鲑
B. lenok钝吻细鳞鲑
B. tumensis0.85052 14.09930 0.09034 0.48123 0.8850 表 5 基于线粒体D-loop序列和微卫星标记分析三个细鳞鲑类群的遗传分化系数FST(左下)与遗传距离(右上)
Table 5 Pairwise FST values (left bottom) and genetic distance (upper right) among three Brachymystax groups based on mtDNA D-loop and microsatellite loci
分子标记
Molecular marker类群
Group秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis尖吻细鳞鲑
B. lenok钝吻细鳞鲑
B. tumensisD-loop区
mtDNA D-loop秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis0.0375 0.0374 尖吻细鳞鲑
B. lenok0.75081* 0.0273 钝吻细鳞鲑
B. tumensis0.66188* 0.36102* 微卫星标记
Microsatellite loci秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis3.6978 3.8246 尖吻细鳞鲑
B. lenok0.6143** 1.4075 钝吻细鳞鲑
B. tumensis0.5992** 0.4606** 注: *P<0.001 代表差异极显著; **Bonferroni校正后仍显著Note: *P<0.001 means significant pairwise differences; ** represents significant differences after Bonferroni correction 表 6 基于线粒体D-Loop序列和微卫星标记的3个细鳞鲑类群的分子方差分析
Table 6 Molecular variance (AMOVA) analysis for three Brachymystax groups based on mtDNA D-loop and microsatellite loci
分子标记
Molecular marker变异来源
Source of variation自由度
df平方和
Sum of squares方差组分
Variance
components变异百分率
Percentage of
variation (%)固定系数FST
Fixation indexP-value D-loop区
mtDNA D-loop类群间Among groups 2 5798.867 42.75754 66.57 0.66565 0.0000* 类群内Within groups 214 4595.953 21.47642 33.43 总计 Total 216 10394.820 64.23396 微卫星标记
Microsatellite loci类群间Among groups 2 946.142 3.80785 57.13 FIS=0.32745
FST=0.57128
FIT=0.711670.00000*
0.00000*
0.00000*类群内样本间
Among individuals
within groups189 716.939 0.93573 14.04 样本内 Within individuals 192 369.00 1.92188 28.83 总计 Total 383 2032.081 6.66545 注: *P<0.001 代表差异极显著Note: *P<0.001 means significant pairwise differences 表 7 基于 14 个多态性微卫星位点的3个细鳞鲑类群的遗传多样性分析结果
Table 7 Results of genetic diversity analysis based on fourteen polymorphism microsatellite loci in three Brachymystax groups
多态性位点
Polymorphic locus参数
Paramen-ters类群Group 秦岭细鳞鲑
B. lenok tsinlingensis
(N=81)尖吻细鳞鲑
B. lenok
(N=40)钝吻细鳞鲑
B. tumensis
(N=71)14 Na 3.0714 7.1429 5.8571 Ne 1.9389 3.0806 3.3276 I 0.6055 1.0806 1.0153 Ho 0.2055 0.2679 0.3571 He 0.3245 0.4619 0.4709 PIC 0.2919 0.4399 0.4334 FIS 0.36823 0.42322 0.24285 注: 等位基因数(Na); 有效等位基因数(Ne); 香农信息指数(I); 观测杂合度(Ho); 期望杂合度(He); 多态信息含量(PIC); 平均近交系数(FIS)Note: Na. Observed number of alleles; Ne. Effective number of alleles; I. Shannon’s Information index; Ho. observed heterozygosity; He. Expected heterozygosity; PIC. polymorphism information content; FIS. Fixation indices -
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