PREPARATION OF POLYCLONAL ANTIBODIES TO CYHV-2 ORF66 TRUNCATED PROTEIN AND SCREENING OF INTERCALATING PEPTIDES
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摘要: 为深入探究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)在感染过程中的生物学功能, 构建了ORF66截短基因的原核表达质粒pET28a-tORF66, 转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) 16℃诱导蛋白表达, 经尿素溶解透析获得溶解的重组蛋白后免疫6周龄小鼠, 制备鼠抗tORF66多克隆抗体。将纯化后重组蛋白进行噬菌体展示以此来筛选互作蛋白。经Western Blot检测显示, 抗体能够识别感染鲫鳍条细胞系GICF细胞中的鲤疱疹病毒Ⅱ型, 效价较高, 特异性较好。噬菌体淘选结果通过生物信息学分析显示, 得到一条出现频次最高的多肽N′-LHLHQNRMSLSR-C′。该多肽与金鱼基因组中的3个基因有较高的同源性, 推断其可能与rORF66重组蛋白相互作用。这将为深入探究ORF66在CyHV-2病毒感染过程中的生物学功能、开发抗CyHV-2病毒新药物及寻找潜在的药物靶点提供新依据。Abstract: Cyprinid herpesvirus 2 (CyHV-2) causes herpesviral haematopoietic necrosis, which is a serious threat to the health of the crucian carp farming industry. ORF66 is an immunogenic capsid protein of CyHV-2. To investigate the biological function of cyprinid herpesvirus 2 during infection, a prokaryotic expression plasmid pET28a-tORF66 with ORF66 truncated gene was constructed based on a region with abundant antigenic table, transformed into BL21 receptor cells and then induced to express the protein using IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) at 16℃. The lysed recombinant protein was obtained by urea lysis dialysis and then immunized in 6-week-old mice to prepare a murine anti-tORF66 polyclonal antibody. The solubilised recombinant proteins were screened for intercalating peptides by phage display techniques. The Western Blot assay showed that the antibody was able to recognize CyHV-2 in infected GICF cells with high potency and good specificity. The results of the phage elution showed by bioinformatics analysis that a peptide with the highest frequency of occurrence, N′-LHLHQNRMSLSR-C′, was obtained. The polypeptide has high homology with three genes in the goldfish genome, including the leukotriene B4 receptor 1 (BLT1) gene, which has six consecutive amino acid repeats with the polypeptide, so it is inferred that the polypeptide may interact with the rORF66 recombinant protein. This will provide a new basis for an in-depth investigation of the biological function of ORF66 during CyHV-2 virus infection, the development of new anti-CyHV-2 virus drugs and the search for potential drug targets.
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Keywords:
- CyHV-2 /
- ORF66 truncated protein /
- Polyclonal antibody /
- Prokaryotic expression /
- Phage display
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鲫(Carassius auratus)是我国重要的淡水养殖品种之一。鲫养殖范围广、养殖成本低, 市场价格相对较高, 且营养价值丰富, 深受养殖者与消费者欢迎。随着水产养殖业的不断发展及养殖规模的壮大, 鲫的病害问题日益突出。由鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)引起的疱疹病毒性造血器官坏死症(Herpesviral haematopoietic necrosis, HVHN)是近年鲫的主要病害之一, 其严重威胁着鲫养殖业的健康发展[1]。CyHV-2与鲤疱疹病毒I型和Ⅲ型(CyHV-1和CyHV-3)都属鲤疱疹病毒科。CyHV-1对鲤(Cyprinus carpio)、鲫、圆腹雅罗鱼(Leuciscue idus)、鲤与金鱼(Carassius auratus auratus)杂交种等均有危害, 但与另外两种病毒相比其危害性更小[2]。CyHV-3对鲤科鱼类以及其杂交种都具有危害性, 金鱼通常为CyHV-3潜在携带者[2]。而CyHV-2相比于CyHV-1和CyHV-3对宿主的选择则相对较少, 仅有鲫、金鱼及其普通变种可被此病毒感染, 目前尚无其他鱼种及物种感染发病的报道[3]。
CyHV-2为全长约290304 bp的线性双链DNA病毒, 呈24面体衣壳状, 直径约为110—120 nm; 具有囊膜的CyHV-2粒子直径约为175—200 nm [4]。目前已公开发表的CyHV-2全基因序列有7株[5]。李莉娟等[6]通过测序发现, CyHV-2中国株SY-C1全长289365 bp, 含有约150个开放阅读框, 与日本株ST-J1相比具有98.8%的序列同源性。CyHV-2 ORFs中仅有ORF72、ORF78和ORF79等的功能得到验证[1, 7—10]。高娃等[4, 11]鉴定出CyHV-2的8种免疫原性蛋白, 即ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132, 其中ORF66、ORF72和ORF92为衣壳蛋白, ORF66更是首次被报道的具有免疫原性的衣壳蛋白。目前已有学者利用ORF92、ORF72和ORF66编码的衣壳蛋白制备的单克隆抗体进行免疫学检测方法的研究, 但尚未见ORF66在CyHV-2感染过程中的生物学功能相关的报道[12—14]。衣壳蛋白具有较好的免疫原性, 可以诱发机体产生特异性免疫[15], 因此探究ORF66在CyHV-2病毒感染过程中的生物学功能具有重大意义。
噬菌体展示技术(Phage Display Technique, PDT)由Smith GP在20世纪80年代首次提出[16, 17], 因其快速方便在免疫学等领域得到广泛应用。其原理是利用基因重组技术将外源性编码多肽或蛋白的DNA序列(基因)剪接到编码噬菌体衣壳蛋白的基因中, 使外源氨基酸序列的遗传信息融合到衣壳蛋白的内源氨基酸上, 形成“杂交”融合蛋白展示于噬菌体的表面[18]。再通过蛋白质之间的相互作用进行3—5轮的生物淘洗, 即可迅速高效地筛选出具有相互作用的目的蛋白或多肽[19]。病毒病的危害促使了更多抗体类、多肽类抗病毒药物的研发, 噬菌体展示技术也顺势成为当下筛选抗病毒药物最流行的技术之一[20, 21]。有研究利用噬菌体展示技术筛选出了4个与猪呼吸与生殖免疫综合征病毒具有较高亲和力的多肽, 并且鉴定出这4个多肽为抗病毒药物的潜在靶点[22]。万偲佳等[23]通过噬菌体展示技术成功筛选出与草鱼呼肠孤病毒 NS31 蛋白互作蛋白。
本实验对ORF66截短基因进行原核表达, 构建原核表达载体pET-28a-tORF66, 在小鼠中制备截短蛋白的多克隆抗体, 同时通过噬菌体展示技术筛选与rORF66蛋白相互作用的多肽, 以期为CyHV-2 ORF66编码蛋白生物学功能研究和CyHV-2鉴定与防治手段的开发提供新的技术参考。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
CyHV-2毒株由本实验室分离并保存; 鲫鳍条细胞系(GICF)[23]由本实验室构建并保存; M199培养液购于吉诺生物技术有限公司; 血清购于武汉普诺赛生物; 限制性核酸内切酶、DH5α、BL21购买于北京全式金生物技术有限公司; T4连接酶、Pyrobest DNA Polymerase、 PrimeSTAR Max DNA Polymerase购于TaKaRa公司; Seamless Cloning Kit购自碧云天(Beyotime Biotechnology)公司; pET-28a(+)等原核表达质粒、Ph. D. -12TMPhage噬菌体展示试剂盒由本实验室保存; PF级6周龄BALB/c小鼠购自上海市实验动物研究中心。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他分子生物学试剂制剂等分别购自天根生化科技(北京)有限公司、Sigma-Aldrich公司、Promega公司、Bio-Rad公司和Thermo公司。
1.2 rORF66基因的扩增
利用生物信息学软件DNA star对ORF66编码蛋白的抗原表位进行分析预测, 筛选出具有丰富抗原表位的232—335aa区域作为目的截短蛋白。根据CyHV-2 ORF66 (GenBank: AKC02013.1)基因序列设计ORF66基因扩增引物(F: 5′-ATGGGTCGCGGATCCGAATTCCGAGGAAGTCTCACCAAACTC-3′; R: 5′-TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTGAGATTCGATTCGTTCGT-3′)。采用病毒DNA提取试剂盒从已纯化的CyHV-2病毒中提取DNA, 作为基因模板进行扩增ORF66基因。扩增后的PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳, 切胶回收采用DNA纯化试剂盒进行纯化。
1.3 rORF66基因原核表达质粒的构建
参照全式金限制性核酸内切酶说明书, 将原核表达质粒pET-28a(+)置于37℃金属浴中酶切反应1h, 将酶切产物用1.2中的方法进行纯化回收。参照碧云天公司Seamless Cloning连接酶反应体系将酶切后的pET-28a(+)质粒与纯化后的ORF66基因产物进行连接反应50℃、15min。随后将上述产物转化至DH5α感受态细胞中, 通过LB平板(含Kana+)37℃培养, 长出菌落后进行筛选, 以此得到阳性克隆菌落, 随后使用质粒抽提试剂盒, 将提取产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.4 rORF66基因的诱导表达及可溶性分析
参照GE公司pGEX原核表达系统, 将ORF66原核表达重组质粒按照感受态说明书转化至BL21(DE3)中, 加入终浓度为0.5 mmol/L IPTG低温诱导, 置于离心机8500 r/min离心20min, 收集细菌沉淀进行超声破碎至菌液透明, 4℃ 12000 r/min 离心30min, 取沉淀和上清制样进行SDS-PAGE检测。
1.5 目的蛋白的纯化
将菌液沉淀用2 mol/L的尿素经4℃摇床洗涤杂蛋白30min, 加入PMSF(1﹕1000)后4℃、8500 r/min离心30min, 收集沉淀按上述方法增加浓度依次用4、6 和8 mol/L的尿素洗涤。收集洗脱物置于透析袋中, 依次用含降浓度梯度的透析液进行透析, 每个浓度透析至少6h, 透析结束后经PEG20000进行浓缩后收集液体, 将收集的蛋白经SDS-PAGE和Western Blot分析。样品保存于–80℃。
1.6 rORF66多克隆抗体的制备
参照余琳等[24]方法进行rORF66多克隆抗体的制备。将纯化后的ORF66重组蛋白与佐剂按1﹕1混匀乳化, 形成油包膜状态, 随后按100 ng/只进行空腹注射进行免疫小鼠。第1次免疫: 混合抗原与弗氏完全佐剂空腹注射。第2次免疫: 抗原与弗氏不完全佐剂1﹕1混合后注射, 于第1次免疫两周后进行。第3次免疫: 距离上次免疫1周后进行抗原免疫。第4次免疫: 在1周后进行纯抗原免疫。免疫结束1周后眼球取血收集血清检测多克隆抗体效价。血清保存于–80℃。
1.7 rORF66多克隆抗体特异性分析
GICF感染CyHV-2病毒, 分别制备未感染CyHV-2病毒的细胞样品、感染CyHV-2病毒的细胞样品、未诱导大肠杆菌沉淀样、诱导细菌沉淀样、尿素纯化后的rORF66蛋白样品进行Western Blot检测。蛋白样品进行SDS-PAGE电泳, 通过半干转法(2.5 A, 25 V, 4min)转至PVDF膜, 使用含5%牛奶的封闭液封闭1h。制备多克隆抗体稀释液(稀释比例1﹕5000)作为一抗4℃过夜孵育; 次日以PBST摇床震荡漂洗6次, 每次6min, 清除多余抗体; 以HRP标记的羊抗室温孵育2h; 孵育后洗膜8次, 每次6min。随后将PVDF膜进行显色30s, 利用天能ECL胶成像系统进行观察。
1.8 多克隆抗体效价分析
以MOI=10的CyHV-2病毒感染GICF细胞, 接毒6d, 刮下细胞, 800 r/min离心10min, 除去上清液按比例加入适量蛋白上样缓冲液。如1.7所述进行Western Blot检测。将多克隆抗体分别稀释2500、5000、10000、20000和50000倍, 其余步骤与1.7相同。
1.9 ORF66在CyHV-2感染过程中蛋白质水平变化的检测
以MOI=10的CyHV-2病毒感染GICF细胞, 28℃孵育3h, 换含有10%(W:V)胎牛血清的M199培养基, 分别在CyHV-2感染GICF细胞0、24h、48h、72h、96h、120h和144h取细胞蛋白样品(步骤同1.8), 利用实验制备的鼠抗rORF66多克隆抗体和商品化内参抗体兔抗β-actin单抗进行Western Blot检测。
1.10 ORF66在CyHV-2感染过程中mRNA水平变化的检测
感染及取样步骤同1.9, 使用TRIzol试剂从感染CyHV-2的GICF细胞中提取总RNA; 逆转录获得cDNA –20℃保存。使用CFX96实时荧光定量PCR仪(美国伯乐)检测目的基因ORF66。RT-qPCR所使用试剂为TB Green® Premix Ex Taq™ Ⅱ (Tli RNaseH Plus)。设计ORF66基因RT-qPCR扩增引物(F: 5′-GATTCGGGCATCAGAAACGC-3′; R: 5′-GCCCATCACGTAGTAGGCTC-3′), β-actin内参基因RT-qPCR扩增引物(F: 5′-CCATCTCCTGCTCGAAGTC-3′; R: 5′-CACTGTGCCCATCTACGAG-3′)。根据试剂制造商说明书设置扩增程序: 95℃ 30s, 95℃ 5s、60℃ 30s 40个循环, 95℃ 10s, 65℃ 5s。相对定量结果使用2–∆∆Ct法分析。
1.11 ORF66重组蛋白噬菌体文库的淘选
取100 μL终浓度为100 μg/mL ORF66蛋白溶液加入到事先预冷的96孔板中, 对照孔中加入100 μL缓冲液, 调节pH为8.6, 在增湿环境中4℃轻微晃动过夜, 除去包被液后加入封阻液, 4℃至少作用1h, 除尽封阻液后迅速加入TBST充分洗板6—8次。将96孔板加入噬菌体文库进行包被, 于室温缓慢晃动1h, 倒尽孔板中液体,向孔中快速加入TBST旋转式清洗孔板, 除尽孔中液体, 重复动作洗涤10次, 向孔板中加入100 μL洗脱液竞争洗脱下已结合的噬菌体。参照说明书将洗脱下来的洗脱物加入到ER2738培养物中, 37℃ 180 r/min恒温摇床培养4.5h使其进行扩增4℃ 10000 r/min 离心10min 重复离心, 上清液加入PEG/NaCl 4℃放置12h, 10000 r/min离心5min去除上清, 加入1 mL TBS溶解, 重复上述沉淀方法, 最后将沉淀溶于200 μL TBS, 即为第一轮筛选后所得扩增洗脱物。相同步骤筛选第二轮、第三轮。第三轮完成后挑选20个噬菌斑进行测序。
2. 结果
2.1 ORF66表达质粒的构建
提取CyHV-2病毒DNA为模板, 针对CyHV-2 ORF66蛋白第232—335aa区域的氨基酸编码基因设计扩增引物, 扩增后进行电泳得到一条约342 bp条带, 与预期大小相同。将目的条带回收、酶切后连接至pET-28a(+)载体获得重组质粒, 测序结果正确, ORF66表达质粒构建成功。
2.2 目的蛋白rORF66的诱导表达及其可溶性分析
重组质粒转化至BL21(DE3)中, 经诱导表达后超声破碎取样, 分析上清液和沉淀中ORF66蛋白表达情况。SDS-PAGE结果显示, 相较于诱导前细菌沉淀、诱导后细菌沉淀以及超声破碎后上清液, 超声破碎后的沉淀中有一蛋白在17 kD处大量表达, 与ORF66截短蛋白(约为12 kD)融合6×His标签(5 kD)后理论大小17 kD相同。该结果表明本实验获得的rORF66重组蛋白大量存在于包涵体中。
2.3 重组蛋白rORF66的纯化
将超声破碎后的沉淀经不同浓度的尿素进行溶解依次来分析ORF66重组蛋白的纯化情况, SDS-PAGE结果显示(图 1)包涵体经高浓度尿素溶解后, 大量的rORF66溶于尿素中, 其中含有少量的杂蛋白。
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图 1 纯化产物的SDS-PAGE 分析M. 蛋白质Marker; 1. 诱导前细菌沉淀; 2. 诱导细菌超声破碎后的沉淀; 3. 2 mol/L尿素纯化的沉淀; 4. 4 mol/L尿素纯化的沉淀; 5. 6 mol/L尿素纯化的沉淀; 6. 8 mol/L尿素纯化的沉淀Figure 1. SDS-PAGE of purified rORF66M. protein marker; 1. bacterial precipitation prior to induction; 2. sedimentation of induced bacteria after ultrasonic fragmentation; 3. precipitation purified from 2 mol/L urea; 4. precipitation purified from 4 mol/L urea; 5. precipitation purified from 6 mol/L urea; 6. precipitation purified from 8 mol/L urea2.4 多克隆抗体的特异性分析
以rORF66多克隆抗体作为一抗进行Western Blot, 依照结果显示, 尿素纯化的样品泳道中, 一条特异性条带位于约17 kD大小处, 与rORF66基因编码的重组蛋白大小基本一致(图 2), 未诱导细菌总蛋白有微量蛋白表达, 经超声破碎后的细菌沉淀样品泳道中有大量的杂带; 感染CyHV-2后的GICF样品泳道中, 显示出一条特异性条带, 其位置大约在45 kD处, 与CyHV-2 ORF66基因编码蛋白的大小基本一致(图 3), 对照组中未感染病毒细胞未出现条带, 表明制备的多克隆抗体具有较好的特异性。
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图 2 细菌沉淀与纯化His-ORF66的免疫印迹分析M. Marker; 1. 未导细菌沉淀; 2. 8 mol/L尿素纯化的沉淀; 3. 诱导细菌超声破碎后的沉淀Figure 2. Western Blot analysis of bacteria and His-ORF66 with anti-His monoclonal antibodyM. protein marker; 1. precipitate of uninduced bacteria; 2. purified sample from precipitate by 8 mol/L urea; 3. precipitate of induced bacteria![]()
图 3 Western Blot 检测病毒蛋白M. Marker; 1. 健康的GICF细胞; 2. 感染病毒的GICF细胞Figure 3. Western Blot detection of ORF66M. protein marker; 1. healthy GICF cells; 2. infected GICF cells2.5 多克隆抗体效价分析
以CyHV-2病毒感染的GICF总蛋白为材料,将制备好的鼠抗ORF66多克隆抗体作为一抗孵育, HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗, 经Western Blot检测该多抗效价, 结果显示该rORF66蛋白多抗效价大于1﹕50000(图 4)。
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图 4 多抗效价检测稀释比例: 1. 1﹕2500; 2. 1﹕5000; 3. 1﹕10000; 4. 1﹕20000; 5. 1﹕50000Figure 4. Determination of the titers of the serum antibodyDilution ratios: 1. 1﹕2500; 2. 1﹕5000; 3. 1﹕10000; 4. 1﹕20000; 5. 1﹕500002.6 ORF66在CyHV-2感染过程中蛋白水平变化的检测
将制备的细胞蛋白样品进行Western Blot检测, 结果显示在CyHV-2感染GICF后72h ORF66表达量逐渐提高(图 5)。
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图 5 ORF66在CyHV-2感染过程中的动力表达学Figure 5. Expression dynamics of ORF66 during CyHV-2 infection2.7 ORF66在CyHV-2感染过程中mRNA水平变化的检测
将制备的细胞样品提取RNA后经RT-qPCR分析, 结果显示ORF66基因在感染72h后明显扩增(图 6), 与其在翻译水平趋势基本一致。
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图 6 ORF66在CyHV-2感染过程中的动力表达学Figure 6. Transcription dynamics of ORF66 during CyHV-2 infection2.8 噬菌体筛选滴度分析及互作多肽的鉴定
将每轮筛选的噬菌体空板进行可视化计数观察后(图 7), 再参照Ph.D.-12TMPhage噬菌体展示试剂盒说明书对每一次筛选前后进行滴度测定, 总体来看三轮筛选后的结果与筛选轮数以正相关的趋势上升, 此结果说明筛选结果良好(表 1)。在最后一轮筛选结束后, 随机挑选20个噬菌斑通过DNA序列测定得到筛选后序列结果。将测序结果对比Ph. D.-12TMPhage噬菌体展示试剂盒说明书翻译成氨基酸序列, 通过APE软件分析, 由此筛选出一条与ORF66重组蛋白相互作用的蛋白序列, 判断该多肽序列N′-LHLHQNRMSLSR-C′与rORF66具有较强的亲和力。从NCBI金鱼蛋白文库进行氨基酸序列比对, 预测与白三稀B4受体1(Leukotriene B4 receptor 1-like)、通用转录因子3C多肽2样亚型X1(General transcription factor 3C polypeptide 2-like isoform X1)以及镰尾蛋白同源异构体X1(Sickle tail protein homolog isoform X1)3个金鱼相关基因互作, 其中与宿主白三稀B4受体1有连续6个氨基酸重复, 与一般转录因子3C多肽2样亚型X1有连续5个氨基酸重复, 与镰尾蛋白同源异构体X1有4个连续氨基酸重复, 因此预测rORF66重组蛋白可能与上述多肽互作。
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图 7 噬菌体空斑计数板A. 第一轮筛选; B. 第二轮筛选; C. 第三轮筛选Figure 7. Phage plaque plateA. the first screening round; B. the second screening round; C. the third screening round.表 1 噬菌体展示回收率Table 1. Phage display recovery rate噬菌体库
Phage
library淘选组别
Panning投入量
Input amount
(PFU)回收量
Recovery
amount
(PFU)回收率
Recovery
rate (PFU)12肽
12 peptides1 4.22×1010 2.13×104 0.51×10–6 2 3×1010 0.67×104 0.22×10–6 3 2×1010 1.33×105 0.67×10–5 3. 讨论
目前已有7株CyHV-2毒株完成了全基因组序列的测定, 但学者对其中预测的开放阅读框编码蛋白功能的研究却较少[25]。病毒存在较大的变异性, 在自然环境中病毒随时可能发生变化, 这对病毒病的相关研究造成一定阻碍, 而了解CyHV-2各开放阅读框可能编码蛋白的功能, 将会为CyHV-2感染机制的研究提供新的依据, 同时对开发疱疹病毒性造血器官坏死症防控手段提供技术支撑。
本实验通过生物信息技术将ORF66编码蛋白进行分析, 构建出表达质粒, 经原核表达尿素纯化后腹腔注射小鼠, 以此成功制备出抗CyHV-2 ORF66截短基因编码蛋白的多克隆抗体, 抗体效价较高且特异性好。将该多抗与感染CyHV-2出现CPE(Cytopathic effect)的GICF细胞的总蛋白进行免疫印迹检测, 发现抗体能与病毒特异性结合, 由此表明该多抗可用于CyHV-2的免疫诊断。利用该抗体本实验探究了CyHV-2感染GICF细胞后ORF66编码蛋白在mRNA水平的变化趋势, ORF66编码蛋白在感染120h后才开始随着感染进程大量表达, 结果与其在蛋白质水平的变化趋势基本一致, 该结果显示ORF66编码蛋白后期的大量表达主要用于病毒粒子的装配。
有研究预测ORF66编码蛋白为CyHV-2衣壳三联体亚基1 (Capsid triplex subunits 1), 对被感染生物体而言该蛋白是一种特定的病毒抗原, 能够刺激机体产生免疫反应[11, 12]。通过序列对比发现, 鲤疱疹病毒不同型病毒的ORF66基因序列同源性较低, 造成其编码的蛋白与其同源蛋白在结构上的差异, 这一特点或与CyHV-2病毒特殊的生物学特征有关联, 这也导致了CyHV-2在感染谱上的独特性。
病毒的衣壳蛋白可作为筛选抗病毒药物及病毒疫苗的候选蛋白。基于ORF66编码蛋白具有较好的免疫原性, 本实验利用噬菌体展示技术对纯化后的rORF66重组蛋白进行生物淘选, 通过分析比对推测出一条可能与rORF66相互作用的多肽序列。使用NCBI进行BLAST信息比对, 发现有3个金鱼基因与该条多肽有多个相互作用的多肽位点, 其中白三稀B4受体1(BLT1), 在其他研究中被证明可能与炎症反应有关[26]。白三稀B4作为一种炎症介导因子, 与人类的多种炎症疾病关系密切, 在免疫反应中发挥着重要的作用, 当宿主受到病原感染时, 释放的白三稀B4能够诱发炎症反应并加强巨噬细胞对病原体的吞噬能力[27]。BLT1作为白三稀B4的高亲和力受体, 主要表达于白细胞表面, 能够活化和介导白细胞向炎症部位迁移。有研究证明BLT1在斑马鱼早期胚胎发育、病原感染及蛋白免疫过程中也发挥了重要的作用[28]。综上所述, BLT1可能在CyHV-2病毒侵染宿主的过程中也发挥了作用, BLT1与ORF66编码蛋白的互作关系可能为ORF66编码蛋白生物学功能及其致病机制的研究奠定基础, 为开发抗CyHV-2病毒的新型药物及预测宿主抗病毒药物的作用靶点提供帮助。
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图 1 纯化产物的SDS-PAGE 分析
M. 蛋白质Marker; 1. 诱导前细菌沉淀; 2. 诱导细菌超声破碎后的沉淀; 3. 2 mol/L尿素纯化的沉淀; 4. 4 mol/L尿素纯化的沉淀; 5. 6 mol/L尿素纯化的沉淀; 6. 8 mol/L尿素纯化的沉淀
Figure 1. SDS-PAGE of purified rORF66
M. protein marker; 1. bacterial precipitation prior to induction; 2. sedimentation of induced bacteria after ultrasonic fragmentation; 3. precipitation purified from 2 mol/L urea; 4. precipitation purified from 4 mol/L urea; 5. precipitation purified from 6 mol/L urea; 6. precipitation purified from 8 mol/L urea
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图 2 细菌沉淀与纯化His-ORF66的免疫印迹分析
M. Marker; 1. 未导细菌沉淀; 2. 8 mol/L尿素纯化的沉淀; 3. 诱导细菌超声破碎后的沉淀
Figure 2. Western Blot analysis of bacteria and His-ORF66 with anti-His monoclonal antibody
M. protein marker; 1. precipitate of uninduced bacteria; 2. purified sample from precipitate by 8 mol/L urea; 3. precipitate of induced bacteria
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图 3 Western Blot 检测病毒蛋白
M. Marker; 1. 健康的GICF细胞; 2. 感染病毒的GICF细胞
Figure 3. Western Blot detection of ORF66
M. protein marker; 1. healthy GICF cells; 2. infected GICF cells
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图 4 多抗效价检测
稀释比例: 1. 1﹕2500; 2. 1﹕5000; 3. 1﹕10000; 4. 1﹕20000; 5. 1﹕50000
Figure 4. Determination of the titers of the serum antibody
Dilution ratios: 1. 1﹕2500; 2. 1﹕5000; 3. 1﹕10000; 4. 1﹕20000; 5. 1﹕50000
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图 5 ORF66在CyHV-2感染过程中的动力表达学
Figure 5. Expression dynamics of ORF66 during CyHV-2 infection
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图 6 ORF66在CyHV-2感染过程中的动力表达学
Figure 6. Transcription dynamics of ORF66 during CyHV-2 infection
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图 7 噬菌体空斑计数板
A. 第一轮筛选; B. 第二轮筛选; C. 第三轮筛选
Figure 7. Phage plaque plate
A. the first screening round; B. the second screening round; C. the third screening round.
表 1 噬菌体展示回收率
Table 1 Phage display recovery rate
噬菌体库
Phage
library淘选组别
Panning投入量
Input amount
(PFU)回收量
Recovery
amount
(PFU)回收率
Recovery
rate (PFU)12肽
12 peptides1 4.22×1010 2.13×104 0.51×10–6 2 3×1010 0.67×104 0.22×10–6 3 2×1010 1.33×105 0.67×10–5 
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